Maxamovo–Gilbertovo sekvenování
Maxamovo–Gilbertovo sekvenování je metoda sekvenování DNA vyvinutá Allanem Maxamem a Walterem Gilbertem v letech 1976–1977. Tato metoda je založena na modifikaci DNA pro jednotlivé nukleové báze a následném štěpení DNA v místech přiléhajících k modifikovaným bázím. [1]
Maxamovo–Gilbertovo sekvenování byla první široce přijatou metodu pro sekvenování DNA, a spolu se Sangerovou metodou, představuje metodu první generace sekvenování DNA. Maxamovo–Gilbertovo sekvenování se již v širokém měřítku nepoužívá, bylo totiž nahrazeno metodami 2. a 3. generace.
Historie[editovat | editovat zdroj]
I přesto, že Maxam a Gilbert zveřejnili svá pozorování dva roky poté, co Frederick Sanger a Alan Coulson publikovali své práce na „plus-minus“ sekvenování,[2][3] Maxamovo–Gilbertovo sekvenování se rychle stalo populární, protože čtená DNA může být použita přímo, zatímco původní Sangerova metoda vyžaduje, aby každé čtení bylo provázeno tvořením kopií čteného fragmentu. S rozvojem moderních sekvenačních metod (454 sekvenování, Illumina), popularita Maxamova–Gilbertova sekvenování klesla a vzhledem k jeho technické složitosti a rozsáhlému používání nebezpečných chemických látek, je jeho použití v standardních molekulárně-biologických soupravách vyloučeno.[4]
Postup[editovat | editovat zdroj]
Maxamovo–Gilbertovo sekvenování vyžaduje radioaktivní značení na 5' konci DNA čteného fragmentu (typicky prostřednictvím gama-32P ATP). Chemické reakce „rozlamují“ čtený úsek na jedné nebo dvou ze čtyř nukleotidových bází v každé ze čtyř reakcí (A+G ,G, C, C+T). Například puriny (A+G) jsou „rozlamovány“ pomocí kyseliny mravenčí, guaniny (a do jisté míry adeniny) jsou methylovány dimethylsulfátem a pyrimidiny (C+T) jsou hydrolyzovány pomocí hydrazinu. Přidání soli (chlorid sodný) k reakci hydrazinu inhibuje reakce thyminu pouze na rozpad cytosinu.
Fragmenty vznikající ve čtyřech reakcích jsou za působení elektroforézy odděleny podle délky s pomocí gelové elektroforézy. Pro zobrazení fragmentů seřazených podle délky je použita autoradiografie, která zaznamenává radioaktivní záření 32P. [5]
Související metody[editovat | editovat zdroj]
Tato metoda vedla k objevu nových postupů, které pomohli vědcům pochopit chemické vlastnosti DNA.[6]
Automatizované Maxamovo–Gilbertovo sekvenování bylo vyvinuto v roce 1994.[7]
Reference[editovat | editovat zdroj]
V tomto článku byl použit překlad textu z článku Maxam–Gilbert sequencing na anglické Wikipedii.
- ↑ Maxam AM, Gilbert W. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. February 1977, s. 560–4. DOI 10.1073/pnas.74.2.560. PMID 265521. Bibcode 1977PNAS...74..560M.
- ↑ Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol.. May 1975, s. 441–8. DOI 10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID 1100841.
- ↑ Sanger F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Nobel lecture, 8 December 1980.
- ↑ Graziano Pesole; Cecilia Saccone. Handbook of comparative genomics: principles and methodology. New York: Wiley-Liss, 2003. Dostupné online. ISBN 0-471-39128-X. S. 133.
- ↑ Cold Spring Harbor Protocols - Chemical Sequencing [online]. Dostupné online.
- ↑ Dostupné online.
- ↑ BOLAND, EJ; PILLAI, A; ODOM, MW; JAGADEESWARAN, P. Automation of the Maxam-Gilbert chemical sequencing reactions.. BioTechniques. Jun 1994, s. 1088–92, 1094–5. PMID 8074875.