Značení pomocí aminokyselin se stabilními izotopy v buněčné kultuře

Z Wikipedie, otevřené encyklopedie
Skočit na navigaci Skočit na vyhledávání
Princip SILAC. Buňky jsou odlišně značeny jejich pěstováním v médiu s normálním argininem (Arg-0, modrá barva) nebo médiu s těžkým argininem (Arg-6, červená barva). Metabolické začlenění aminokyselin do proteinů vede k posunu hmoty odpovídajících peptidů. Tento hmotnostní posun lze detekovat hmotnostním spektrometrem, jak je indikováno zobrazenými hmotnostními spektry. Když jsou oba vzorky smíchány, poměr intenzit píků v hmotnostním spektru odráží relativní množství proteinu. V tomto příkladu má značený protein stejné množství v obou vzorcích (poměr 1).

Značení pomocí aminokyselin se stabilními izotopy v buněčné kultuře (SILAC; z angl. Stable Isotope Labeling by/with Amino acids in Cell culture) je technika založená na hmotnostní spektrometrii, která detekuje rozdíly v množství proteinů mezi vzorky pomocí neradioaktivního izotopového značení.[1][2][3] Je to populární metoda pro kvantitativní proteomiku.

Postup[editovat | editovat zdroj]

V buněčné kultuře se kultivují dvě populace buněk. Jedna z buněčných populací je živena růstovým médiem obsahujícím normální aminokyseliny. Naproti tomu druhá populace buněk je živena růstovým médiem obsahujícím aminokyseliny značené stabilními (neradioaktivními) těžkými izotopy. Například, médium může obsahovat arginin značený šesti atomy uhlíku-13 (13C) místo normálního uhlíku-12 (12C). Buňky během svého růstu v tomto médiu tak začleňují těžký arginin do všech svých proteinů. Díky tomu jsou pak všechny peptidy obsahující jeden arginin o 6 Da těžší než jejich normální protějšky. Alternativně lze použít jednotné značení 13C nebo 15N. Proteiny z obou buněčných populací jsou poté smíchany a analyzovány společně pomocí hmotnostní spektrometrie, nebot páry chemicky identických peptidů různého izotopového složení mohou být rozlišeny v hmotnostním spektrometru díky jejich hmotnostnímu rozdílu. Poměr intenzit jednotlivých píků v hmotnostním spektru pro takové peptidové páry pak odráží poměr množství pro dva proteiny.[3][4]

Aplikace[editovat | editovat zdroj]

SILAC zahrnující inkorporaci tyrosinu značeného devíti atomu uhlíku-13 (13C) místo normálního uhlíku-12 (12C), byla použita ke studiu substrátů tyrosinkinázy v signálních drahách.[5] SILAC se ukázal jako velmi účinná metoda pro studium buněčné signalizace, posttranslačních modifikací (např. fosforylace), protein-proteinových interakcí a regulace genové exprese. Kromě toho se SILAC stal důležitou metodou v sekretomice, globálním studiu sekretovaných proteinů a sekrečních drah.[6] Může být použit k rozlišení mezi proteiny vylučovanými buňkami v kultuře a sérovými kontaminanty.[7] Byly také publikovány standardizované protokoly SILAC pro různé aplikace.[8][9]

Pulzní SILAC[editovat | editovat zdroj]

Pulzní SILAC (pSILAC) je variantou metody SILAC, kde se značené aminokyseliny přidávají do růstového média pouze na krátkou dobu. To umožňuje sledovat rozdíly v produkci proteinu de novo spíše než v jejich následné finální koncentraci.[10]

SILAC byl také použit ke studiu tolerance biofilmu k antibiotikům, aby se odlišily tolerantní a citlivé subpopulace.[11]

NeuCode SILAC[editovat | editovat zdroj]

Úroveň multiplexování v SILAC byla tradičně omezena kvůli počtu dostupných izotopů SILAC. Nedávno nová technika nazvaná NeuCode (neutronové kódování) SILAC zvýšila úroveň multiplexování dosažitelnou metabolickým značením (až 4).[12] Aminokyselinová metoda NeuCode je podobná SILAC, ale liší se tím, že značení využívá pouze těžké aminokyseliny. Použití pouze těžkých aminokyselin eliminuje potřebu 100% začlenění aminokyselin potřebných pro SILAC. Zvýšená schopnost multiplexování aminokyselin NeuCode je způsobena použitím hmotnostních defektů z extra neutronů ve stabilních izotopech. Tyto malé hmotnostní rozdíly však musí být vyřešeny na hmotnostních spektrometrech s vysokým rozlišením.

Reference[editovat | editovat zdroj]

V tomto článku byl použit překlad textu z článku Stable isotope labeling by amino acids in cell culture na anglické Wikipedii.

  1. ODA, Y.; HUANG, K.; CROSS, F. R. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1999-06-08, roč. 96, čís. 12, s. 6591–6596. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 0027-8424. DOI 10.1073/pnas.96.12.6591. 
  2. JIANG, Heng; ENGLISH, Ann M. Quantitative Analysis of the Yeast Proteome by Incorporation of Isotopically Labeled Leucine. Journal of Proteome Research. 2002-05-18, roč. 1, čís. 4, s. 345–350. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1535-3893. DOI 10.1021/pr025523f. 
  3. a b ONG, Shao-En; BLAGOEV, Blagoy; KRATCHMAROVA, Irina. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2002-05, roč. 1, čís. 5, s. 376–386. PMID: 12118079. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1535-9476. DOI 10.1074/mcp.m200025-mcp200. PMID 12118079. 
  4. SCHOETERS, Floris; VAN DIJCK, Patrick. Protein-Protein Interactions in Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 2019, roč. 10, s. 1792. PMID: 31440220 PMCID: PMC6693483. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1664-302X. DOI 10.3389/fmicb.2019.01792. PMID 31440220. 
  5. IBARROLA, Nieves; MOLINA, Henrik; IWAHORI, Akiko. A novel proteomic approach for specific identification of tyrosine kinase substrates using [13C]tyrosine. The Journal of Biological Chemistry. 2004-04-16, roč. 279, čís. 16, s. 15805–15813. PMID: 14739304. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 0021-9258. DOI 10.1074/jbc.M311714200. PMID 14739304. 
  6. HATHOUT, Yetrib. Approaches to the study of the cell secretome. Expert Review of Proteomics. 2007-04, roč. 4, čís. 2, s. 239–248. PMID: 17425459. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1744-8387. DOI 10.1586/14789450.4.2.239. PMID 17425459. 
  7. POLACEK, Martin; BRUUN, Jack-Ansgar; JOHANSEN, Oddmund. Differences in the secretome of cartilage explants and cultured chondrocytes unveiled by SILAC technology. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 2010-08, roč. 28, čís. 8, s. 1040–1049. PMID: 20108312. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1554-527X. DOI 10.1002/jor.21067. PMID 20108312. 
  8. AMANCHY, Ramars; KALUME, Dario Eluan; PANDEY, Akhilesh. Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) for studying dynamics of protein abundance and posttranslational modifications. Science's STKE: signal transduction knowledge environment. 2005-01-18, roč. 2005, čís. 267, s. pl2. PMID: 15657263. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1525-8882. DOI 10.1126/stke.2672005pl2. PMID 15657263. 
  9. HARSHA, H. C.; MOLINA, Henrik; PANDEY, Akhilesh. Quantitative proteomics using stable isotope labeling with amino acids in cell culture. Nature Protocols. 2008, roč. 3, čís. 3, s. 505–516. PMID: 18323819. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1750-2799. DOI 10.1038/nprot.2008.2. PMID 18323819. 
  10. SCHWANHÄUSSER, Björn; GOSSEN, Manfred; DITTMAR, Gunnar. Global analysis of cellular protein translation by pulsed SILAC. Proteomics. 2009-01, roč. 9, čís. 1, s. 205–209. PMID: 19053139. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1615-9861. DOI 10.1002/pmic.200800275. PMID 19053139. 
  11. CHUA, Song Lin; YAM, Joey Kuok Hoong; HAO, Piliang. Selective labelling and eradication of antibiotic-tolerant bacterial populations in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature Communications. 2016-02-19, roč. 7, s. 10750. PMID: 26892159 PMCID: PMC4762895. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 2041-1723. DOI 10.1038/ncomms10750. PMID 26892159. 
  12. MERRILL, Anna E.; HEBERT, Alexander S.; MACGILVRAY, Matthew E. NeuCode labels for relative protein quantification. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2014-09, roč. 13, čís. 9, s. 2503–2512. PMID: 24938287 PMCID: PMC4159665. Dostupné online [cit. 2022-01-19]. ISSN 1535-9484. DOI 10.1074/mcp.M114.040287. PMID 24938287. 

Externí odkazy[editovat | editovat zdroj]