Wikipedista:Adéla Fejfarová/Analýza cytometrických dat

Z Wikipedie, otevřené encyklopedie

Analýza cytometrických dat je zpracování údajů získaných průtokovou cytometrií. Z rozboru naměřených hodnot fyzikálních vlastností lze vyvozovat biologické vlastnosti buněk. Na základě konkrétních parametrů je možné určit např. počet a velikost buněk, množství DNA, nebo identifikovat jednotlivé populace buněk v heterogenním vzorku. Pojem analýzy dat zahrnuje veškeré nakládání s daty po vlastním měření vzorku. Tedy například eliminaci pozadí, mrtvých buněk, jejich částí („debris“), nebo naopak několika spojených buněk („dublety“), vlastní označení populací a také statistické vyhodnocení.

Mezi měřené parametry patří boční rozptyl světla (SSC, „side scatter“), přímý rozptyl (FSC, „forward scatter“), intenzita fluorescence a čas. Fluorescence buněk je zprostředkovaná vazbou fluoroforu. Fluorofor je často navázán na protilátku, díky čemuž jsou označeny konkrétní molekuly v buňce. Nejběžnějším příkladem analyzovaných dat je aplikace cytometrie v hematologii – analýza heterogenního vzorku zlyzované krve (bez erytrocytů). Podle SSC a FSC se dají leukocyty rozdělit na populaci lymfocytů, monocytů a granulocytů. Pro bližší stanovení subpopulací s určitými znaky se používá značení protilátkami.

Gating[editovat | editovat zdroj]

Vizualizace a úprava dat pro jejich interpretaci probíhá v prostředí počítačových softwarů. Pro zobrazení cytometrických dat existuje několik možností: jednodimenzionální histogram, dvouparametrový dotplot, nebo 3D zobrazení tří markerů. Na každém z těchto zobrazení lze uměle označit určitý prostor, respektive soubor buněk. Takovéto označení populace buněk se anglicky nazývá „gating“. Tyto podmnožiny jsou charakteristické silou signálu zobrazeného na ose. Zobrazení na osách je pro SSC a FSC většinou lineární, pro intenzitu fluorescence logaritmické nebo biexponenciální. Tvary ohraničení („gate“) jsou různé: polygon, elipsa, obdélník, nebo rozdělení vzorku do kvadrantů.[1]

Ohraničení populací je umělé a podléhá individuálnímu úsudku. Pro kontrolu takovéto analýzy slouží „backgating“[2], kdy je poslední označená subpopulace promítnuta do předešlých ohraničení. Touto metodou lze rozpoznat chybně vyznačenou podmnožinu buněk.

Kompenzace[editovat | editovat zdroj]

Během analýzy multiparametrických dat je nutná tzv. kompenzace fluorescence. Při značení buněk několika fluorofory dochází ke spektrálnímu překryvu emisních spekter. Vyzářené fotony jsou detekovány filtrem pro určitou vlnovou délku, emisní spektrum ale zasahuje s nižší intenzitou i do jiných vlnových délek, tedy jiných detektorů. Za kompenzaci se označuje matematická oprava tohoto přesvitu („spillover“). Správná kompenzace pomocí FMO kontrol ("fluorescence minus one") je klíčová pro přesnou interpretaci dat.[3]

Softwarové nástroje[editovat | editovat zdroj]

Pro klasickou analýzu ručním vytvářením gatů existuje několik softwarů. Příkladem volně dostupného základního softwaru je FCSalyzer[4], mezi komerční patří např. FlowJo[5] a Kaluza[6]. Tato manuální analýza tvorbou gatů má značné nevýhody. Populace jsou označeny na základě subjektivního rozhodnutí, což znemožňuje reprodukovatelnost. Dalším problémem je detekce vzácných populací. Tyto potíže jsou zřejmé především v analýze multiparametrických dat.[7]

V důsledku technického pokroku, díky kterému je možné měřit mnoho parametrů na velkém počtu buněk, došlo k vývoji softwarů pro automatickou analýzu. Nesupervizované automatické metody tvoří pomocí shlukové analýzy tzv. klastry, tedy populace buněk se stejnými markery. Výhodou je schopnost rozpoznání vzácných populací a rychlost analýzy velkých dat. Při porovnání několika automatických softwarů[8] se jako nejlepší ukázaly FlowSOM[9], X-shift[10], Rclusterpp[11].

Reference[editovat | editovat zdroj]

  1. ↑ SHAPIRO, Howard M. Practical flow cytometry. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, 2003. ISBN 978-0-471-41125-3. S. 27-43. 
  2. ↑ LOKEN, M. R. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 1990, roč. 11, čís. 4, s. 453-459. ISSN 0196-4763. DOI https://doi.org/10.1002/cyto.990110402. 
  3. ↑ ROEDERER, Mario. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 2001, roč. 45, čís. 3, s. 194-205. ISSN 1097-0320. DOI https://doi.org/10.1002/1097-0320(20011101)45:3<194::AID-CYTO1163>3.0.CO;2-C. 
  4. ↑ https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
  5. ↑ https://www.flowjo.com/
  6. ↑ https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza
  7. ↑ WEBER, Lukas M.; ROBINSON, Mark. Comparison of clustering methods for high-dimensional single-cell flow and mass cytometry data. Cytometry Part A. 2016, roč. 89, čís. 12, s. 1084-1096. ISSN 1552-4930. DOI https://doi.org/10.1002/cyto.a.23030. 
  8. ↑ WEBER, Lukas M.; ROBINSON, Mark. Comparison of clustering methods for high-dimensional single-cell flow and mass cytometry data. Cytometry Part A. 2016, roč. 89, čís. 12, s. 1084-1096. ISSN 1552-4930. DOI https://doi.org/10.1002/cyto.a.23030. 
  9. ↑ VAN GASSEN, Sofie. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 2015, roč. 87, čís. 7, s. 636-645. ISSN 1552-4930. DOI https://doi.org/10.1002/cyto.a.22625. 
  10. ↑ SAMUSIK, Nikolay. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 2016, roč. 13, čís. 6, s. 493-496. ISSN 1548-7105. DOI https://doi.org/10.1038/nmeth.3863. 
  11. ↑ Linderman M. Rclusterpp: Linkable C++ clustering. R package version 0.2.3.; 2013
Citováno z „https://cs.wikipedia.org/w/index.php?title=Wikipedista:Adéla_Fejfarová/Analýza_cytometrických_dat&oldid=19451232“