Stain Index
Stain Index (Staining index) je veličina, jejíž hodnota udává relativní intenzitu barvení fluoroforem.[1]
Symbol veličiny: SI
Historie
[editovat | editovat zdroj]Poprvé tento termín a jeho využití v průtokové cytometrii představil David Parks ze Stanfordovy univerzity na ISAC Annual Meeting v Montpellier, Francie 2004[2]. Zavedení Stain indexu (SI) zrychlilo a zefektivnilo navrhování experimentů pro průtokovou cytometrii, jež se v té době začala rychle rozvíjet a jako metoda molekulární biologie se začala masivně využívat ve výzkumu a lékařské diagnostice.
Využití
[editovat | editovat zdroj]
Při navrhování vícebarevného panelu je nutné optimalizovat výběr protilátek s fluorofory a jejich ředění. Právě stain index se k této optimalizaci využívá.
Dle hodnot SI lze jednotlivé fluorofory přiřadit jednotlivým antigenům. Obecně by mělo platit pravidlo, že svítivějšími fluorofory by se měly označovat protilátky párující se s méně exprimovanými antigeny či antigeny, které se vyskytují intracelulárně.[3]
Dále se využívá při výběru vhodného ředění protilátek. Pro optimalizaci experimentu je důležité maximalizovat signál a zároveň redukovat "pozadí". Titrace protilátek a měření SI pomáhá redukovat pozadí, které je způsobeno nespecifickým párováním protilátek s nízkoaffinitními antigeny.[4] Při titraci se vzorky barví sestupnou ředící řadou protilátek a měří se průtokovým cytometrem. Ve výsledných datech se za použití počítačového programu pro analýzu cytometrických dat označí negativní a pozitivní populace singletových buněk. Z takto vybraných dat se vypočítá SI pro jednotlivá ředění a sestaví se titrační křivka. Nejvhodnějším ředěním protilátky pro využití v experimentu je ředění s nejvyšší hodnotou SI.[5] Výběr vhodného ředění protilátky umožňuje získání maximálně kvalitních dat a zároveň šetří drahé zásoby protilátek.[6]
Rovnice pro výpočet SI
[editovat | editovat zdroj]
Stain index udává podíl rozdílu MFI (median fluorescent intensity) pozitivní a negativní populace a dvojnásobku směrodatné odchylky SD (standard deviation) negativní populace.
Tento zjednodušený vztah vychází z podrobnějšího vztahu pro výpočet tzv. Separačního indexu (SI). Dvojnásobek směrodatné odchylky je zde nahrazen rozdílem 84. percentilu negativní populace a MFI negativní populace, který je dělen 0,995. Vztah ve jmenovateli vyjadřuje výpočet rSD (robust standard deviation).
![{\displaystyle SI={(MFI_{poz}-MFI_{neg}) \over [(84\%_{neg}-MFI_{neg})/0,995]}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/806ca51f59ea1a925548fa99880742517ad06707)
Reference
[editovat | editovat zdroj]- ↑ 5 Essential Calculations For Accurate Flow Cytometry Results | Expert Cytometry | Flow Cytometry Training. Expert Cytometry. 2018-01-10. Dostupné v archivu pořízeném dne 2018-08-21. (anglicky)
- ↑ DANYLEYKO, Jeri. Stain Index Calculations using Flow Cytometry Software The Stain Index (SI)1 is a normalized signal to background metric useful. webcache.googleusercontent.com [online]. [cit. 2018-08-21]. Dostupné online.
- ↑ EDINGER, Mark. Multicolor Flow Cytometry: Principles of Panel Design. webcache.googleusercontent.com [online]. [cit. 2018-08-21]. Dostupné online.
- ↑ Importance of Antibody Titration in Flow cytometry - Bitesize Bio. Bitesize Bio. 2015-02-17. Dostupné online [cit. 2018-08-21]. (anglicky)
- ↑ SHEERAR, Dagna. Titrating Antibodies for Flow Cytometry. webcache.googleusercontent.com [online]. [cit. 2018-08-21]. Dostupné online.
- ↑ BIO-RAD. Antibody Titration - Flow Cytometry Guide | Bio-Rad. Bio-Rad. Dostupné online [cit. 2018-08-21]. (anglicky)
- ↑ BioLegend Blog - The Stain Index: What Is It and What Does It Tell You?. www.biolegend.com [online]. [cit. 2018-08-16]. Dostupné v archivu pořízeném dne 2018-08-16.
- ↑ TELFORD, William G.; BABIN, Sergey A.; KHOREV, Serge V. Green fiber lasers: An alternative to traditional DPSS green lasers for flow cytometry. Cytometry Part A. 2009-12, roč. 75A, čís. 12, s. 1031–1039. Dostupné online [cit. 2018-08-16]. ISSN 1552-4922. DOI 10.1002/cyto.a.20790. PMID 19777600. (anglicky)