CUBIC
CUBIC (zkratka z anglického clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis)[1] je histologická metoda, která umožňuje zprůhlednění objemných vzorků tkáně. Ty pak mohou být analyzovány s využitím fluorescenční mikroskopie mnohem rychleji a snáze, než pomocí klasických histologických metod.
Metoda byla publikovaná v roce 2014, primárně pro zobrazování mozků modelových organismů používaných v neurobiologii (hlodavci, malí primáti).[1] V následujících letech byla zopakovaná dalšími laboratořemi a použitá na různé tipy tkání jako lymfatickou uzlinu[2], mléčnou žlázu[3] či lidskou nádorovou tkáň.[4] CUBIC také lze kombinovat s dalšími metodami pro zprůhledňování tkáni.[1][5]
Chemie a provedení metody
[editovat | editovat zdroj]Neprůhlednost nervové tkáně je daná zejména rozptylem světla na rozhraních mezi prostředími s různými indexy lomu, v tomto případě zejména mezi lipidy, proteiny a vodou.[6] Zprůhlednění vzorků je založené zejména na delipidaci tkáně, a následném ponoření do média s obdobným indexem lomu jako má vzorek.[1][6]
Vývoj metodiky byl inspirován již dříve publikovaným protokolem pro zprůhlednění mozkové tkáně nazvaný Scale (směs glycerolu, močoviny a detergentu), který je velmi jednoduchý a skvěle zachovává fluorescenci.[7] Autoři CUBIC provedli testování 40 chemikálií, obdobných těm používaným ve Scale, s cílem nalézt takové které budou stejně dobře zachovávat fluorescenci ale přitom budou ještě lépe zprůhledňovat tkáně. Zjistili že pro tento účel jsou ideální bazické aminoalkoholy, které díky aminoskupině dobře solvatují lipidy a jejichž bazicita napomáhá zachovat fluorescenci.[1] Aminoalkoholy mají navíc schopnost zbavovat tkáň hemu, díky tomu se CUBIC hodí i pro projasňování tkání, které jsou neprůhledné kvůli množství světla absorbovaného krevním barvivem.[7]
Původní protokol[8] se skládá z dvoufázové inkubace fixované tkáně ve dvou roztocích zajišťujících zprůhlednění (v originále "clearing solutions"). První roztok nazývaný ScaleCUBIC-1, CUBIC-1 či pouze reagencie-1, je složen z N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediaminu (komerčně prodávaného pod názvem Quadrol), močoviny a Tritonu X-100 (detergent) ve vodě. Druhý roztok s názvem ScaleCUBIC-2, CUBIC-2 či reagencie-2 je vodným roztokem močoviny a sacharózy.[9] Originální protokol může být pro aplikace na různé tkáně částečně modifikován, zejména v koncentracích jednotlivých reagencií, inkubačních dobách či v samotném složení jednotlivých roztoků.[4][8][10] Při použití perfuze může být CUBIC protokol využit i ke zprůhlednění celých orgánů či těl hlodavců.[8] Kromě toho mohou být roztoky používané pro CUBIC využity i jako médium sloužící ke sjednocení indexu lomu (v originále "refractive index matching solution") pro vzorky, které jsou zprůhledněné pomocí CLARITY ale kvůli obsahu většího množství hemoglobinu zůstávají částečně neprůhledné.[5]
Aplikace metody
[editovat | editovat zdroj]Velkou výhodou CUBIC metodiky je její univerzálnost v použití na různé druhy tkání, díky schopnosti aminoalkoholů zprůhlednit téměř jakékoliv orgány či celé tělo myši.[8] Výhodou je také to, že používané roztoky nejsou toxické, ani nehrozí poškození mikroskopu v případě, že přijde do kontaktu se vzorkem či některým s roztoků (jak je tomu u metod založených na 3DISCO).[6] Na druhou stranu jsou roztoku pro CUBIC viskózní a relativně špatně se s nimi manipuluje. Nevýhodou je nekompatibilita s lipofilními barvivy vzhledem k vysoké koncentraci detergentů[11] a v porovnání se zmíněnými metodami navazujícími na 3DISCO stále o něco delší čas nutný ke zprůhlednění vzorků.[6][12] Vysoká koncentrace detergentů také může mít negativní vliv na fluorescenci a strukturu tkáně.[12]
CUBIC protokol byl optimalizován a použit pro širokou škálu aplikací a tkání. V myším modelu byl využit pro analýzu interakcí mezi imunitními buňkami v lymfatické uzlině,[2] popis chování kmenových buněk[3] či pro rekonstrukci 3D anatomie jater, ledvin, plic či srdce.[8] Další modifikace CUBIC metodiky byly využity na poli nádorové biologie pro mapování rozvoje metastáz[13] či pro zpracování biopsií z pacientů s nádorovým onemocněním jak z nativní tkáně, tak z formalinem fixovaných a v parafinu uložených vzorků.[4]
Reference
[editovat | editovat zdroj]V tomto článku byl použit překlad textu z článku CUBIC na anglické Wikipedii.
- ↑ a b c d e SUSAKI, Etsuo A.; TAINAKA, Kazuki; PERRIN, Dimitri. Whole-Brain Imaging with Single-Cell Resolution Using Chemical Cocktails and Computational Analysis. Cell. 2014-04, roč. 157, čís. 3, s. 726–739. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0092-8674. DOI 10.1016/j.cell.2014.03.042.
- ↑ a b ABE, Jun; OZGA, Aleksandra J.; SWOGER, Jim. Light sheet fluorescence microscopy for in situ cell interaction analysis in mouse lymph nodes. Journal of Immunological Methods. 2016-04, roč. 431, s. 1–10. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0022-1759. DOI 10.1016/j.jim.2016.01.015.
- ↑ a b DAVIS, Felicity M.; LLOYD-LEWIS, Bethan; HARRIS, Olivia B. Single-cell lineage tracing in the mammary gland reveals stochastic clonal dispersion of stem/progenitor cell progeny. Nature Communications. 2016-10-25, roč. 7, s. 13053. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 2041-1723. DOI 10.1038/ncomms13053. PMID 27779190. (En)
- ↑ a b c NOJIMA, Satoshi; SUSAKI, Etsuo A.; YOSHIDA, Kyotaro. CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis. Scientific Reports. 2017-08-24, roč. 7, čís. 1. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 2045-2322. DOI 10.1038/s41598-017-09117-0. PMID 28839164. (En)
- ↑ a b LEE, Eunsoo; CHOI, Jungyoon; JO, Youhwa. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 2016-01-11, roč. 6, čís. 1. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 2045-2322. DOI 10.1038/srep18631. PMID 26750588. (En)
- ↑ a b c d RICHARDSON, Douglas S.; LICHTMAN, Jeff W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 2015-07, roč. 162, čís. 2, s. 246–257. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0092-8674. DOI 10.1016/j.cell.2015.06.067. PMID 26186186.
- ↑ a b HAMA, Hiroshi; KUROKAWA, Hiroshi; KAWANO, Hiroyuki. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 2011-08-30, roč. 14, čís. 11, s. 1481–1488. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1097-6256. DOI 10.1038/nn.2928. (En)
- ↑ a b c d e TAINAKA, Kazuki; KUBOTA, Shimpei I.; SUYAMA, Takeru Q. Whole-Body Imaging with Single-Cell Resolution by Tissue Decolorization. Cell. 2014-11, roč. 159, čís. 4, s. 911–924. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0092-8674. DOI 10.1016/j.cell.2014.10.034.
- ↑ SUSAKI, Etsuo A; TAINAKA, Kazuki; PERRIN, Dimitri. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 2015-10-08, roč. 10, čís. 11, s. 1709–1727. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1754-2189. DOI 10.1038/nprot.2015.085. (En)
- ↑ NEHRHOFF, Imke; BOCANCEA, Diana; VAQUERO, Javier. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 2016-09-01, roč. 7, čís. 9, s. 3716–3720. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 2156-7085. DOI 10.1364/BOE.7.003716. PMID 27699132. (EN)
- ↑ YU, Tingting; QI, Yisong; GONG, Hui. Optical clearing for multiscale biological tissues. Journal of Biophotonics. 2017-12-12, roč. 11, čís. 2, s. e201700187. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1864-063X. DOI 10.1002/jbio.201700187. (anglicky)
- ↑ a b LLOYD-LEWIS, Bethan; DAVIS, Felicity M.; HARRIS, Olivia B. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 2016-12, roč. 18, čís. 1. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1465-542X. DOI 10.1186/s13058-016-0754-9. (En)
- ↑ KUBOTA, Shimpei I.; TAKAHASHI, Kei; NISHIDA, Jun. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 2017-07, roč. 20, čís. 1, s. 236–250. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 2211-1247. DOI 10.1016/j.celrep.2017.06.010.