Přeskočit na obsah

Vodík-deuteriová výměna

Z Wikipedie, otevřené encyklopedie

Vodík-deuteriová (H/D) výměna ve spojení s hmotnostní spektrometrií představuje metodu vhodnou k detekci dynamických strukturních změn proteinů.

Výměna vodíků

Výměnu proteinových vodíků za vodíky z okolního roztoku v roce 1954 poprvé popsali Linderstrom-Lang a Hvidt [1]. K této výměně dochází neustále a to u všech typů proteinů, ale ne všechny vodíky jsou vyměňovány stejnou rychlostí. Vodíky na postranních řetězcích aminokyselin se vyměňují vysokou rychlostí a nejsou tudíž pro měření vhodné. Na druhou stranu vodíky vázané na uhlících se téměř nevyměňují a také nejsou pro měření vhodné. Ideální pro měření jsou vodíky vázané v amidové skupině hlavního proteinového řetězce, které se vyskytují u všech aminokyselin kromě prolinu [2]. Tyto vodíky se podílejí na tvorbě vodíkových můstků a tím i na tvorbě sekundární a terciární struktury.

Rychlost výměny vodíků je závislá na pH, teplotě, přístupu rozpouštědla a přítomnosti intramolekulárních i intermolekulárních vodíkových můstků. U jednotlivých vodíků amidových skupin se rychlost výměny může lišit až o osm řádů v závislosti na prostředí a přítomnosti vodíkových vazeb [3]. Samotná výměna vodíku je nedetekovatelná, proto se ke značení využívají izotopy vodíku, které mají vyšší molekulovou hmotnost. V prvních pokusech se ke značení používalo tritium [4] , ale později se přešlo na používání stabilnějšího deuteria [5]. Díky přibližně dvojnásobné molekulové hmotnosti deuteria oproti vodíku se jeho inkorporací do proteinu zvýší i molekulová hmotnost daného proteinu. Toto zvýšení odpovídá množství inkorporovaného deuteria a lze ho měřit hmotnostním spektrometrem.

Průběh analýzy

Analýza se skládá z několika kroků. Nejprve je protein inkubován v pufru s D2O (těžkou vodou) a následně změnou podmínek je reakce ve stanovených časových intervalech zastavována. Dalším krokem je enzymatické štěpení proteinu s inkorporovaným deuteriem. Takto vzniklé peptidy jsou chromatograficky rozdělovány a analyzovány v hmotnostním spektrometru.

Spuštění reakce

Standardní postup značení probíhá přidáním pufru s D2O k roztoku proteinu za fyziologického pH a pokojové teploty. Změnou vstupních podmínek, jako je pH, složení roztoku či přítomnost ligandu, se mění i množství inkorporovaného deuteria, které odpovídá aktuální strukturní konformaci proteinu. Pro každou ze vstupních podmínek je deuterace provedena v několika různých časových intervalech. Porovnáním výsledků je možné určit, které části proteinu se nacházejí na povrchu (mají vysokou hodnotu deuterace již v krátkých časových intervalech) a které části jsou vodíkovými můstky před výměnou chráněny.

Zastavení reakce

Reakce výměny vodíků za deuteria je zastavována v přesně definovaných časech a to snížením pH na hodnotu 2,1 a současně snížením teploty na 0 °C [6] . V tomto kroku dochází ke snížení rychlosti výměny vodíků a také k denaturaci proteiu, která ulehčuje následující štěpení proteázami [7]. Další kroky analýzy probíhají v pufrech již bez obsahu deuteria, kdy se zvyšuje pravděpodobnost ztráty inkorporovaného deuteria zpětnou výměnou s vodíky v prostředí. Pro minimalizaci zpětné výměny je nutné nadále udržovat teplotu 0 °C, kdy je poločas vodíkové výměny u nesbaleného proteinu přibližně 1h. To znamená, že plně deuterovaný protein vystavený 100% H2O vymění zpět za vodíky polovinu svých deuterií během jedné hodiny.V tento moment je možné značený protein uchovat pro další analýzu zmražením na -80 °C po nezbytně krátkou dobu.

Štěpení proteinu

V dalším kroku je deuterovaný protein podroben proteolytickému štěpení za vzniku směsi peptidů. Kvůli nízkému pH a nízké teplotě nemohou být použity standardně využívané proteázy, jako jsou například trypsin, chymotrypsin a další. Z těchto důvodů je jedním z vhodných a často používaných enzymů pepsin. Volbou proteolytického enzymu můžeme ovlivnit rozlišení analýzy.

HPLC-MS analýza

Peptidy jsou následně separovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na koloně s reverzní fází a měřeny hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením.

Reference

  1. ↑ HVIDT, A.; LINDETSTROM-LANG, K. Exchange of hydrogen atoms in insulin with deuterium atoms in aqueous solutions. Biochim Biophys Acta. 1954, roč. 14, s. 574–575. 
  2. ↑ BAI, Y. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 1993, roč. 17, čís. 1, s. 75–86. 
  3. ↑ ENGEN, R.; SMITH, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange ms. Anal Chem. 2001, roč. 73, čís. 9, s. 256–265. 
  4. ↑ ENGLANDER, S.; POULSEN, A. Hydrogen-tritium exchange of the random chain polypeptide. Biopolymers. 1969, roč. 7, s. 379–393. 
  5. ↑ ZHANG, Z.; SMITH, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: A new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 1993, roč. 2, čís. 4, s. 522–531. 
  6. ↑ ENGLANDER, J. J.; ROGERO, J. R.; ENGLANDER, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 1985, roč. 147, čís. 1, s. 234–244. 
  7. ↑ HAMURO, Y.; COALES, S. J.; SOUTHERN, M. R. Rapid analysis of protein structure and dynamics by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J Biomol Tech. 2003, roč. 14, čís. 3, s. 171–182. 
Citováno z „https://cs.wikipedia.org/w/index.php?title=Vodík-deuteriová_výměna&oldid=20362151“