FASTQ

FASTQ je textový soubor sloužící k uchování biologické sekvence (typicky nukleotidové sekvence) a také nese informace o skóre kvality jednotlivých nukleotidů. Samotné báze sekvence, tak i skóre kvality je zakódováno jedním ASCII znakem. Skóre kvality udává, s jakou pravděpodobností byla konkrétní báze určena chybně.

Formát byl původně vytvořen ve Welcome Trust Sanger Institute, aby do jednoho souboru bylo možno uložit informaci jak o sekvenci, tak i o kvalitě dat. Díky tomu se stal standardem pro uchovávání výstupů z high-throughput sekvenátorů.

FASTQ soubory mohou obsahovat až několik milionů znaků a mohou dosahovat velikosti až několik gigabytů, což je často dělá moc velkými na to, aby mohly být otevřeny v běžném textovém editoru. FASTQ soubory totiž typicky obsahují velké množství sekvencí. Často je ale není potřeba otevírat, protože jsou vstupními soubory pro následné analýzy jako je například alignment k referenčnímu genomu nebo de novo sestavování genomu. Pokud by ale uživatel chtěl soubor zobrazit je vhodné k tomu použít systém Unix nebo Linux které umožňují zobrazení velkých souborů přes příkazovou řádku.

FASTQ soubor se skládá ze 4 řádků:

• Pole 1 začíná znakem @ a je následováno identifikátorem sekvence a volitelným popisem jako jsou třeba informace o sekvenaci.
• Pole 2 je složeno z písmen samotné sekvence.
• Pole 3 začíná znakem + a také může být také následováno stejným identifikátorem či různým popisem.
• Pole 4 nese informaci o skóre kvality jednotlivých písmen ze řádku 2. Musí obsahovat stejný počet znaků jako řádek 2.

FASTQ soubor obsahující jednu sekvenci může vypadat takto:

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

Kvalita

Hodnoty kvality neboli Q skóre jsou reprezentovány ASCII znaky. Znak reprezentující nejnižší kvalitu je "!" a nejvyšší kvalitu reprezentuje znak "~". Znaky (celkem 94) jsou pak zleva doprava seřazeny od nejnižší kvality po nejvyšší takto:

!"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~

Sekvenační kvalita dané báze Q je definována následujícím vztahem:

$Q_{\ }=-10\,\log _{10}p$

kde p je předpokládaná pravděpodobnost chybně určené báze. Vyšší Q skóre indikuje menší pravděpodobnost chyby. Nižší Q skóre naopak vyšší pravděpodobnost chyby. Kvality skóre 20 (Q20) znamená 1 chybu na 100 znaků, což odpovídá přesnosti 99 %. Q30 se považuje za měřítko kvality pro sekvenování nové generace (NGS).

Encoding

Způsob kódování kvality se liší v závislosti na použitém přístroji a softwaru pro určování bází (tzv. basecaller). Například formát Phred+33 používaný při Sangerovu sekvenování kóduje skóre kvality od 0 do 93 a využívá pro to ASCII znaky s kódem 33 až 126. Nejnižší kvalita (0) odpovídá tedy ASCII znaku 33, což je !. Dalšími formáty je Phred+64 a Solexa+64, kdy kvalitě 0 odpovídá ASCII znak 64. Rozdíl mezi Phred+64 a Solexa+64 je, že u kódování Solexa může hodnota kvality dosáhnout záporné hodnoty -5. Nejpoužívanější je ale formát Phred+33 a je využíván většinou používaných přístrojů. Typická kvalita většinou nepřesahovala 40. Což se s nástupem sekvenování nové generace či vylepšováním technik mění a jsme schopni tuto hodnotu přesáhnout. Nevýhodou je, pokud některé nástroje či skripty se setkají s hodnotou kvality vyšší než 40, může to vést jejich selhání či chybám.

  SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS.....................................................
  ..........................XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX......................
  ...............................IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII......................
  .................................JJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ.....................
  LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL....................................................
  NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN...........................................
  EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE
  PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP
  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~
  |                         |    |        |              |               |                     |
 33                        59   64       73             88             104                   126
  0........................26...31.......40                                
                           -5....0........9.............................40 
                                 0........9.............................40 
                                    3.....9..............................41 
  0.2......................26...31........41                              
  0..................20........30........40........50
  0..................20........30........40........50...55
  0..................20........30........40........50..........................................93

 S - Sanger        Phred+33,  typická kvalita hrubých dat (0, 40)
 X - Solexa        Solexa+64, typická kvalita hrubých dat (-5, 40)
 I - Illumina 1.3+ Phred+64,  typická kvalita hrubých dat (0, 40)
 J - Illumina 1.5+ Phred+64,  typická kvalita hrubých dat (3, 41)
     kde 0=nepoužito, 1=nepoužito, 2=Kontrolní indikátor kvality segmentu čtení (tučně). 
 L - Illumina 1.8+ Phred+33,  typická kvalita hrubých dat (0, 41)
 N - Nanopore      Phred+33,  typická kvalita duplexových dat (0, 50)
 E - ElemBio AVITI Phred+33,  typická kvalita hrubých dat (0, 55)
 P - PacBio        Phred+33,  typická kvalita HiFi dat (0, 93)