Polymorfismus délky restrikčních fragmentů: Porovnání verzí

Skočit na navigaci Skočit na vyhledávání
doplnění popisu metody RFLP a jejího základního využití
(doplnění restrikčního místa, upřesnění mechanismu samotné restrikce.)
(doplnění popisu metody RFLP a jejího základního využití)
'''Polymorfismus délky restrikčních fragmentů''' ('''RFLP''' – ''restriction fragment length polymorphism'', vyslovováno někdy „riflip“) je označení pro jev, při němž se po rozštěpení několika vzorků [[DNA]] od různých jedinců pomocí zvláštních [[enzym]]ů ([[Restrikční endonukleáza|restrikčních endonukleáz]]) projeví rozdíly v délce takto vzniklých DNA [[restrikční fragment|restrikčních fragmentů]]., Tytokteré jsou detekovatelné prostřednictvím gelové [[Elektroforéza|elektroforézy]]. rozdílyRozdíly jsou způsobeny odchylkami ve stavbě těchtopůvodních řetězců DNA (v jejich sekvenci), které buďto obsahují rozpoznávací řetězec nukleotidů pro restrikční endonukleázy (restrikční místo) a může dojít ke štěpení dvoušroubovice DNA, nebo restrikční místo neobsahují a ke štěpení nedojde.
 
RFLP byla první obecně rozšířenou metodou analýzy DNA, má praktické využití v postupech, které zjišťují genetické rozdíly mezi několika jedinci jednoho druhu. KonkrétněPřed serozvojem používáostatních ktechnik byla důležitým nástrojem pro mapování genomu, lokalizaci genů pro genetické poruchy, hodnocení rizika onemocnění a testování otcovství. Příkladem praktického využití může být [[prenatální test|prenatálnímprenatální testůmtest]] na [[srpkovitá anémie|srpkovitou anémii]]. Zde konkrétně je podkladem pro takové testy polymorfismus délky restrikčních fragmentů [[gen]]u pro [[beta-globin]]. Podobné metody někdy využívá také [[genetická daktyloskopie]] určená k zjišťování identity osob <ref>{{citace monografie| titul = A Dictionary of Genetics, Seventh Edition | autor = ROBERT C. KING; WILLIAM D. STANSFIELD; PAMELA K. MULLIGAN | vydavatel = Oxford University Press| rok=2006 | jazyk = anglicky }}</ref>.
 
[[Soubor:RFLP mapping.svg|náhled|nahoře|Princip RFLP. Homologní sekvence jsou naštípány restrikčními endonukleázami a získané fragmenty odděleny prostřednictvím gelové elektroforézy.]]
== Literatura ==
 
* {{citace monografie| titul = A Dictionary of Genetics, Seventh Edition | autor = ROBERT C. KING; WILLIAM D. STANSFIELD; PAMELA K. MULLIGAN | vydavatel = Oxford University Press| rok=2006}}
== Princip metody ==
Základem RFLP je štěpení izolované DNA restrikčními endonukleázami. Běžně se používají takové, které štěpí tzv. [[Palindrom (genetika)|palindromatické sekvence]], tedy ty, které mají stejné pořadí basí, čteme-li je v opačných směrech od štěpného místa. Příkladem používaných enzymů může být [[EcoRI]] izolovaný z bakterie ''[[Escherichia coli]]'', nebo HindIII (''[[Haemophilus influenzae]]''), HpaI (''[[Haemophilus parainfluenzae]]''),či AluI (''[[Arthrobacter luteus]]''). První dva jmenované enzymy stříhají molekulu DNA tak, že vznikají "lepivé, kohezní" konce (angl. sticky ends), užitím dalších dvou pak lze získat úseky DNA s "tupými" konci (angl. sticky ends)<ref name="a">{{Citace monografie
| příjmení = Briggs
| jméno = David
| příjmení2 = Walters
| jméno2 = Stuart Max
| titul = Proměnlivost a evoluce rostlin
| vydavatel = Univerzita Palackého v Olomouci
| místo = Olomouc
| rok = 2001
| počet stran = 531
| kapitola = 6
| isbn = 80-244-0186-X
}}</ref>.
[[Soubor:EcoRI restriction enzyme recognition site.svg|náhled|vpravo|Restrikční místo enzymu EcoRI, oddělení sekvencí naznačeno zelenou čarou.]]
 
Po štěpení DNA jedním nebo více restrikčními enzymy jsou vzniklé fragmenty separovány pomocí gelové elektroforézy (DNA má uniformní negativní náboj a její fragmenty putují od anody ke katodě, přičemž jejich mobilita závisí pouze na jejich velikosti). Získaný vzor na gelu nemusí být zřetelný, proto se cílí na vybrané úseky
<ref name="b">{{Citace monografie
| příjmení = Buckingham
| jméno = Lela
| titul = Molecular Diagnostics: Fundamentals, Methods and Clinical Applications
| vydavatel = F.A. Davis
| místo = Philadelphia
| rok = 2012
| počet stran = 558
| isbn = 978-0-8036-2677-5
| jazyk = anglicky }}</ref>
Používá se tzv. "[[Southernův přenos|Southernův přenos]]" (angl. Southern blotting, the blotting paper = piják) k přenesení DNA z gelu na pevné médium, membránu z nitrocelulózy nebo nylonu, přičemž je zachována poloha jednotlivých fragmentů DNA. K membráně se přidá specifická jednovláknová sonda, tou může být definovaný gen nebo segment DNA či RNA známého původu označený radioaktivní chemikálií, či [[Chemiluminiscence|chemoluminiscenční]] látkou. Používají se buď [[Lokus (genetika)|lokusově]] specifické sondy (např. pro biosystematické studie rostlin je využívána [[ribozomální RNA]]), nebo multilokusové, schopné rozeznat opakující se sekvence ([[VNTR]])<ref name="a"/>.
 
U fragmentů, které jsou komplementární k DNA sondy, dojde k hybridizaci. Po následném vymytí zůstanou na membráně pouze ty, které hybridizovaly.
 
== Využití ==
RFLP je první metoda, která byla využívána pro mapování genomu. Prostřednictvím srovnání výsledků získaných za použití různých restrikčních enzymů vznikla v roce 1987 první [[genetická mapa]] [[Lidský genom|lidského genomu]]<ref>{{Citace elektronické monografie
| titul = 1987a: First Human Genetic Map
| url = https://www.genome.gov/25520325/
| datum přístupu =2017-08-19
| vydavatel = National Human Genome Research Institute
| jazyk = anglicky
}}</ref>. Významná je i aplikace v lékařství. Na základě RFLP byly odhaleny pozice některých genů, jejichž mutace mohou mít patologické projevy (např. byl takto lokalizován gen [[BRCA1]], jehož mutace je prekurzorem [[Rakovina|rakoviny]] prsu a vaječníků<ref name="b"/>, či gen [[Cystická fibróza|cystické fibrózy]] ([[CFTR]])<ref>{{Citace periodika
| příjmení = Kerem
| jméno = Bat-sheva
| příjmení2 = Rommens
| jméno2 = Johanna M.
| příjmení3 = Buchanan
| jméno3 = Janet A.
| příjmení4 = Markiewicz
| jméno4 = Danuta
| příjmení5 = Cox
| jméno5 = Tara K.
| příjmení6 = Chakravarti
| jméno6 = Aravinda
| příjmení7 = Buchwald
| jméno7 = Manuel
| titul = Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Genetic Analysis
| periodikum = Science
| odkaz na periodikum = [[Science]]
| rok = 1989
| měsíc = září
| ročník = 245
| číslo = 4922
| strany = 1073-1080
| url = http://www.jstor.org/stable/pdf/1704306.pdf?seq=1#page_scan_tab_contents
| issn = 1095-9203
| jazyk = anglicky
}}</ref>).
RFLP byla též používána pro identifikaci osob, či určování otcovství. V neposlední řadě nalezla uplatnění ve fylogeografii a biosystematice rostlin a živočichů <ref>{{Citace monografie
| příjmení = Weiss
| jméno = Steven
| příjmení2 = Ferrand
| jméno2 = Nuno
| titul = Phylogeography of Southern European Refugia
| url = https://books.google.cz/books?id=Rh8Ff13e9lQC&dq=rflp+refugia&hl=cs&source=gbs_navlinks_s
| vydavatel = Springer
| místo = Dordrecht
| rok = 2007
| počet stran = 376
| isbn = 978-1-4020-4903-3
| jazyk = anglicky
}}</ref>.
 
== Další metody ==
Vlastní metoda RFLP vyžaduje relativně velké množství DNA, proto se dnes častěji používají metody založené na PCR. Výchozí množství DNA pro RFLP lze prostřednictvím PCR také zvýšit, jedná se pak o tzv. PCR-RFLP, jednou z odvozených metod je tzv. T-RFLP (Terminal RFLP), která je používaná pro analýzu environmentálních vzorků (např. porovnání mikrobiálních společenstev).
 
 
== Reference ==
{{reflist}}
 
== Odkazy ==
[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrflp/ Metoda RFLP na webu NCBI]
 
== Související články ==
* [[Genetický polymorfismus]]
* [[Molekulární marker]]
 
{{Pahýl}}
 
{{Portály|Biologie|Chemie}}
49

editací

Navigační menu