Imunoassay

Z Wikipedie, otevřené encyklopedie
Skočit na navigaci Skočit na vyhledávání

Imunoassay je metoda podobná chromatografii na tenké vrstvě, ale podstatně přesnější. Tato metoda je založena na imunologické reakci antigenu (analyt) s protilátkou (činidlo). V podstatě jde o sledování základní imunitní reakce proti zvolené droze nebo metabolitu, ale problém je, že drogy nebo metabolity imunitní reakci v organismu běžně nevyvolávají.

Získání protilátky[editovat | editovat zdroj]

Běžný postup[editovat | editovat zdroj]

Běžnou cestou je výroba protilátek hypersenzibilizací zvířete (typicky krá­líka, nebo slepic – protilátka pak je ve vejcích) drogou spojenou s proteinem mnohdy tisíckrát větším než je droga sama. Droga navázaná na protein se nazývá hapten a vzniklému komplexu říkáme imunogen. Po vstupu imunogenu do organismu a po určité inkubační době se odebere krev zvířete a protilátky se z krve vyizolují a pročistí, čímž vznikne antisérum. Čím silnější je reakce antiséra s antigenem, tím je vyšší titr séra. Ten udává, do jakého zředění bude reakce zhruba průkazná, takže titr běžných antisér 1:500 značí, že budou reagovat na imunogen zhruba do zředění 1:500. Antisérum vyprodukované touto cestou není tvořeno jednou čistou protilátkou, ale spíše směsí rozdílných protilátek specifických proti různým oblastem imunogenu a takováto antiséra se označují jako polyklonální a mohou se lišit, dokonce i když pocházejí ze stejného zvířete. Pro důvěryhodnou analýzu je toto zásadní problém.

Aby se alespoň částečně zamezilo možnosti chyb, tak se například sportovcům odebírá vzorků víc a testují se postupně s různými časovými intervaly. V případě, že dva sportovci dopovali stejnou dávkou nandrolonu, ale půl roku po sobě a na analýzu se použijí dvě odlišné šarže protilátek, tak jednou sportovci doping dokáží, ale druhému ne.

Vylepšený postup[editovat | editovat zdroj]

Určitým krokem ke zlepšení byl vynález produkce monoklonálních protilátek. Tento postup je obdobný jako u běžného postupu. Prvním krokem je vložení imunogenu do zvířete, ale zvíře se po inkubační době zabije a odeberou se mu buňky sleziny. Tyto buňky produkují protilátky. Jejich spojením s rakovinnými buňkami vzniknou téměř nesmrtelné buňky. Nakonec se vyberou ty nejlepší z nich (produkují protilátky, které se na antigen vážou nejúčinněji) a udržují se v konstantních podmínkách. Takové buňky neustále produkují vysoce specifická antiséra s vysokým titrem. Přesto i tyto takřka dokonalé protilátky mohou reagovat s látkami se strukturami podobnými analytu. (např. neškodný efedrin reaguje s antisérem proti amfetaminu/metamfetaminu)

I přes některé výhody se může stát, že protilátka bude reagovat i s látkou, proti níž není určena, což občas vede k falešně pozitivním výsledkům, a proto se imunoassay používá jen jako přibližná metoda k odlišení vzorků. Její výho­dou je její snadná automatizace, takže je možné současně analyzovat desítky či stovky vzorků.

Literatura[editovat | editovat zdroj]

  • Berson S. A., Yalow R. S., Bauman A., Rothschild M. A. and Newerly K., Insulin-I131 metabolism in human subjects: demonstration of insulin binding globulin in the circulation of insulin treated subjects, Journal of Clinical Investigation, vol. 35, no. 2, 170-190 (1956)
  • Yalow R. S. and Berson S. A., Immunoassay of endogenous plasma insulin in man, Journal of Clinical Investigation, vol. 39, no. 7,1157-1175 (1960)
  • Yalow R. S. and Berson S. A., Immunoassay of plasma insulin in man, Diabetes, vol. 10, no. 5, 339-344 (1961)
  • Wide L. and Porath J., Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies, Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, vol. 130, no. 1, 257-260 (1966)
  • Nakane P. K. and Pierce G. B. Jr., Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens, Journal of Cell Biology, vol. 33, no. 2, 307-318 (1967)
  • Avrameas S., Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies, Immunochemistry, vol. 6, no. 1, 43-52 (1969)
  • Engvall E. and Perlmann P., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G, Immunochemistry, vol. 8, no. 9, 871-874 (1971)
  • van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M., Immunoassay using antigen-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 15, no. 3, 232-236 (1971)
  • van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M., Immunoassay using hapten-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 24, no. 1, 77-81 (1972)
  • Pittman J. A. Jr., RIA: An historical note, Clinical Chemistry, vol. 19, no. 7, 793 (1973)
  • van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M,, Immunoassay using antibody-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 43, no. 2, 215-218 (1974)
  • Voller A., Bidwell D. E. and Engvall E., A microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay and its application to malaria, Bulletin of the World Health Organization, vol. 51, no. 2, 209-211 (1974)
  • Voller A., Bidwell D. E. and Bartlett A., Enzyme immunoassays in diagnostic medicine, Bulletin of the World Health Organization, vol. 53, no. 1, 55-65 (1976)
  • Yalow R. S., Citation Classic, Current Contents, 14, 98 (1977)
  • Yalow R. S., Radioimmunoassay: a probe for the fine structure of biologic systems, Science, vol. 200, no. 4347, 1236-1245 (1978)
  • Engvall E., Citation Classic, Current Contents, 12, 16 (1987)
  • Voller A. and Bidwell D. E., Better health care with microplate ELISA, Citation Classic, Current Contents, 17, 14 (1989)
  • Mujumdar R. B., Ernst L. A., Mujumdar S. R. and Waggoner A. S., Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups, Cytometry, vol. 10, no. 1, 11-19 (1989)
  • Yalow R. S., Remembrance project: origins of RIA, Endocrinology, vol. 129, no. 4, 1694-1695 (1991)
  • Engvall E., Perspective on the historical note on EIA/ELISA by Dr. R. M. Lequin, Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2225 (2005)
  • van Weemen B. K., The rise of EIA/ELISA, Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2226 (2005)
  • Lequin R. M., Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2415-2418 (2005)
  • Avrameas S., Historical background of the invention of EIA and ELISA, Clinical Chemistry, vol. 52, no. 7, 1430-1431 (2006)
  • Hammarström S., Berzins K., Biberfeld P., Engvall E., Hammarström M.-L., Holm G., Troye-Blomberg M. and Wahlgren M., Peter Perlmann 1919-2005, Scandinavian Journal of Immunology, vol. 63, no. 6, 487-489 (2006)

Externí odkazy[editovat | editovat zdroj]