Fluorescenčně značená protilátka
Fluorescenčně značené protilátky označují konjugát specifické monoklonální protilátky s fluoroforem. Značené protilátky se hojně využívají například v průtokové cytometrii nebo fluorescenční mikroskopii k diagnostickým nebo zobrazovacím účelům.[1] Poprvé byly fluorescenčně značené protilátky popsány v roce 1942 a využity k detekci antigenních determinant v savčí tkáni.[2]
Fluorofor je navázán na konstantní část protilátky kovalentní vazbou. Tato vazba se může uskutečnit přes amino, thiolovou nebo hydroxylovou skupinu.[3] Na jednu molekulu protilátky se při konjugační reakci může navázat vyšší počet molekul fluoroforu. Počet fluorescenčních molekul je ale omezený, neboť větší množství fluoroforů by se mohlo navzájem zhášet a tím snižovat intenzitu fluorescence. Konjugační reakce by v ideálním případě neměla mít vliv na aviditu protilátky.[4] Průměrný počet fluorescenčních molekul navázaných na protilátku je definován jako "stupeň značení" (DOL, z angl. degree of labeling) a může být určen na základě absorpčního spektra značené protilátky.[5]
V současné době existuje velké množství fluorescenčních molekul využívaných k vazbě na monoklonální protilátky. Mezi běžně využívané fluorofory patří například fluorescein (FITC), phycoerythrin (PE) nebo allophycocyanin (APC). Pro rozšíření spektra fluorescenčních markerů a pro použití v mnohobarevných analýzách se také využívají tandemové (z angl. tandem dyes) nebo polymerní (z angl. polymer dyes) barvy.[6] Tandemové barvy využívají přenosu energie (FRET) mezi dvěma kovalentně vázanými fluorofory (donorem a akceptorem). Výsledkem je zvýšení rozdílu mezi excitačním a emisním spektrem (Stokesův posuv) tandemové barvy, jejíž emisní spektrum je tak možné odlišit od emisního spektra donorové molekuly.[7] Hojně využívaná tandemová barva je například PE-Cy7 (phycoerythrin kovalentně vázaný s malou molekulou cyanine 7).
Využití v průtokové cytometrii[editovat | editovat zdroj]
Průtoková cytometrie a třídění (sorting) buněk je založené na vazbě fluorescenčně značených protilátek na povrchové nebo intracelulární znaky buněk. Specifická vazba epitopu a protilátky zajistí označení vybraných molekulárních znaků specifickým fluoroforem. Na základě rozličné intenzity fluorescence a emisních spekter jednotlivých fluoroforů je pak možné rozlišit a kvantifikovat jednotlivé buněčné populace a případně je třídit.[8]
Využití ve fluorescenční mikroskopii[editovat | editovat zdroj]
Ve fluorescenční mikroskopii je využití fluorescenčně značených protilátek označováno jako imunofluorescence. V označení cílové struktury se využívá přímé nebo nepřímé detekce. K zobrazení fluorescenčně označených molekulárních struktur se využívá fluorescenční mikroskop, vybavený speciálními lasery k excitaci fluoroforů a odpovídajícími filtry k detekci emisních spekter.[9]
Přímá a nepřímá detekce[editovat | editovat zdroj]
Přímá a nepřímá detekce využívá fluorescenčně značených protilátek v rozdílných stádiích značení. Přímá detekce využívá primární protilátku značenou fluorescenční molekulou pro bezprostřední rozpoznání cílové struktury. Nepřímá detekce využívá značené protilátky až v druhém kroku po označení cílové struktury první neznačenou protilátkou.[10]
Odkazy[editovat | editovat zdroj]
Reference[editovat | editovat zdroj]
- ↑ BIOLABS, Creative. What Are Fluorescent Antibodies? » ADC Review » Creative Biolabs. ADC Review [online]. 2019-07-30 [cit. 2020-07-07]. Dostupné online. (anglicky)
- ↑ IMMUNOLOGISTS, American Association of. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody. The Journal of Immunology. 1942-11-01, roč. 45, čís. 3, s. 159–170. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 0022-1767. (anglicky)
- ↑ SZABÓ, Ágnes; SZENDI-SZATMÁRI, Tímea; UJLAKY-NAGY, László. The Effect of Fluorophore Conjugation on Antibody Affinity and the Photophysical Properties of Dyes. Biophysical Journal. 2018-02-06, roč. 114, čís. 3, s. 688–700. PMID: 29414714 PMCID: PMC5985035. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 0006-3495. DOI 10.1016/j.bpj.2017.12.011. PMID 29414714.
- ↑ VIRA, Shaleen; MEKHEDOV, Elena; HUMPHREY, Glen. Fluorescent labeled antibodies - balancing functionality and degree of labeling. Analytical biochemistry. 2010-07-15, roč. 402, čís. 2, s. 146–150. PMID: 20362543 PMCID: PMC2876214. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 0003-2697. DOI 10.1016/j.ab.2010.03.036. PMID 20362543.
- ↑ GMBH, Abberior. Degree of Labeling (DOI) - Abberior GmbH. www.abberior.com [online]. [cit. 2020-07-07]. Dostupné v archivu pořízeném z originálu dne 2020-07-07.
- ↑ MCKINNON, Katherine M. Flow Cytometry: An Overview. Current protocols in immunology. 2018-02-21, roč. 120, s. 5.1.1–5.1.11. PMID: 29512141 PMCID: PMC5939936. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 1934-3671. DOI 10.1002/cpim.40. PMID 29512141.
- ↑ ICCS eNewsletter. www.cytometry.org [online]. [cit. 2020-07-07]. Dostupné v archivu pořízeném dne 2018-09-12.
- ↑ MCKINNON, Katherine M. Flow Cytometry: An Overview. Current protocols in immunology. 2018-02-21, roč. 120, s. 5.1.1–5.1.11. PMID: 29512141 PMCID: PMC5939936. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 1934-3671. DOI 10.1002/cpim.40. PMID 29512141.
- ↑ SANDERSON, Michael J.; SMITH, Ian; PARKER, Ian. Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2014-10-01, roč. 2014, čís. 10, s. pdb.top071795. PMID: 25275114 PMCID: PMC4711767. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 1940-3402. DOI 10.1101/pdb.top071795. PMID 25275114.
- ↑ OWEN, GETHIN RH.; HÄKKINEN, LARI; WU, CHUANYUE. A Reproducible Technique for Specific Labeling of Antigens Using Preformed Fluorescent Molecular IgG-F(ab’)2 Complexes From Primary Antibodies of the Same Species. Microscopy research and technique. 2010-6, roč. 73, čís. 6, s. 623–630. PMID: 20025053 PMCID: PMC3225404. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 1059-910X. DOI 10.1002/jemt.20803. PMID 20025053.