CRISPR

Z Wikipedie, otevřené encyklopedie
Skočit na: Navigace, Hledání
Princip systému CRISPR/Cas v prokaryotní buňce

CRISPR jsou segmenty nahromaděných pravidelně rozmístěných krátkých palindromických repetic (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)[1]), jsou to úseky prokaryotické DNA obsahující krátké repetice nukleotidů. Každá z repetic je následována krátkými segmenty tzv. spacer DNA, získanými při předchozích setkáních s příslušnými bakteriálními viry nebo plazmidy.[2]

CRISPR / Cas systém je prokaryotický imunitní systém, zajišťující rezistenci vůči cizím genetickým elementům, jako jsou plazmidy nebo fágy,[3],[4] a představuje tedy formu získané imunity. Spacerová DNA tyto exogenní genetické elementy rozpozná a deaktivuje způsobem analogickým s mechanismem RNA interference v eukaryotických organismech.[5] CRISPR lokusy již byly objeveny u přibližně 40% osekvenovaných bakterií a u 90% archeí.[6] Technologie CRISPR interference má enormní potenciál k uplatnění, včetně pozměňování lidské zárodečné linie, zvířat (i dalších organismů) nebo modifikace genů potravinářských plodin. Doručením proteinu Cas9 a příslušné naváděcí RNA do buňky, lze genom cílového organismu rozstřihnout v jakémkoli požadovaném místě.[7][8][9] CRISPRy ve spojení se specifickými endonukleázami, určenými k editování genomu či cílené regulaci genů, již byly otestovány v rozličných organismech[10]. Z etického hlediska se jeví jako znepokojivá zejména možnost editace lidské zárodečné linie.[11]

Historie[editovat | editovat zdroj]

CRISPR je přirozenou součástí bakteriálních procesů. Bakterie mají schopnost začleňovat cizí DNA a dokonce i účelně získávat poškozenou DNA přímo ze svého okolního prostředí.[12] Nahromaděné repetice byly poprvé popsány v roce 1987 u bakterie Escherichia coli na Univerzitě v Osace, vědcem Yoshizumim Ishinou, v té době ovšem jejich funkce nebyla známa.[13] Nezávisle na tom byly tyto repetice pozorovány také španělským badatelem Franciscem Mojicou v roce 1993[14], který je nazval krátkými pravidelně rozmístěnými repeticemi (SRSR).[15] V roce 2000 byly podobné repetice identifikovány u dalších zástupců bakterií a archeí.[16] Na Mojicův návrh byly SRSR roku 2002 přejmenovány na CRISPR.[17][18] Poprvé vyvstalo podezření, že by CRISPR lokusy mohly být zodpovědné za zprostředkování adaptivní imunity u mikrobů.[19][20] Práce zahrhující tyto hypotézy byla prvotně odmítnuta celou řadou vysoce impaktovaných žurnálů.[21][22][23] Byla objevena řada genů, asociovaných s CRISPRovýmy repeticemi, pojmenovaných Cas, neboli CRISPR-associated genes (s CRISPRem-asociované geny). Cas geny kódují nukleázy nebo helikázy, což jsou enzymy, které stříhají (nukleázy) nebo rozvolňují (helikázy) dvoušroubovici DNA[24]. V roce 2005, tři nezávislé výzkumné skupiny prokázaly, že některé DNA spacery z CRISPR lokusu jsou odvozeny z fágové a extrachromozomální DNA, jako jsou plazmidy.[25][26][27] Spacery byly identifikovány jako fragmenty DNA pocházející z virů, které již dříve napadly danou bakteriální buňku. Původ DNA spacerů byl známkou toho, že by CRISPR/Cas systém mohl hrát roli v adaptivní imunitě bakterií.[28][29] Koonin a jeho tým navrhli, že DNA spacery slouží jako templáty pro transkripci RNA molekul analogicky systému zvanému RNA interference uplatňovanému v eukaryotických buňkách[30]. V roce 2007, Barrangou, Horvath (odborníci potravinového průmyslu v Daniscu) a skupina Moineau na Université Laval v Kanadě ukázali, že lze využít spacerovou DNA ke změně rezistence Streptococcus thermophilus vůči útoku fágů.[31] V roce 2012 bylo poprvé ukázáno, že CRISPR může být využit jako nástroj genového inženýrství pro editaci genů v lidské buněčné kultuře.[32][33] Od té doby byl již systém úspěšně vyzkoušen v široké škále organismů od kvasinek (S. cerevisiae),[34] Dania pruhovaného (D. rerio)[35], octomilky (D. melanogaster),[36] Axolotl (A. mexicanum),[37] hlístice (C. elegans),[38] rostlin,[39] myší,[40] opic[41] až po lidská embrya[42]. CRISPR byl modifikován do podoby programovatelných transkripčních faktorů, které vědcům umožňují přesně zacílit a pak aktivovat nebo umlčet specifické geny.[43][36] Nyní jsou již k dispozici knihovny desítek tisíc ověřených naváděcích RNA.[44]

Cas9[editovat | editovat zdroj]

Jennifer Doudna a Emmanuelle Charpentier (nezávisle na sobě) zkoumaly s CRISPRem-asociované proteiny, ve snaze lépe porozumět mechanismu využití DNA spacerů v imunitní obraně bakterií.[45] Obě vědkyně se zaměřily na jednodušší CRISPR systém, který využívá bílkovinu zvanou Cas9. Zjistily, že bakterie reagují na napadení fágem přepisem příslušného DNA spaceru a přilehlých palindromických sekvencí do dlouhé molekuly RNA. Buňka pak použije tracrRNA (trans-activating crRNA) a protein Cas9 k rozstříhání této dlouhé RNA molekuly na kratší kousky zvané crRNA (CRISPR RNA)[46]. Cas9 je nukleáza, enzym, specializovaný pro stříhání DNA. Má dvě aktivní „stříhací“ místa (HNH a RuvC), jeden pro každé vlákno dvoušroubovice DNA. Bylo prokázáno, že lze jedno či obě tato aktivní místa deaktivovat při zachování schopnosti Cas9 vyhledat a navázat cílovou sekvenci v DNA. V roce 2012, Doudna a Charpentier (nyní již ve společné vědecké skupině) zkombinovaly tracrRNA a crRNA do jediné hybridní „guide“ RNA molekuly (gRNA), která je v komplexu s Cas9 schopna přesně zacílit a rozstřihnout libovolnou sekvenci v DNA. Ve své studii navrhly využití takto uměle sestavené naváděcí RNA jako prostředku využitelného k editaci genů.[47]

Předchůdci CRISPR/Cas9 systému[editovat | editovat zdroj]

Na přelomu tisíciletí, vědci vyvinuli tzv. Zinc-finger nukleázy (nespecifické nukleázy spojené se zinkovými prsty, syntetickými proteiny, jejichž DNA-vazebné domény umožňují rozeznávat specifické sekvence v DNA) umožňující vytvářet dvojřetězcové zlomy v DNA na předem vybraných místech. V roce 2010, s objevem syntetických nukleáz zvaných TALENy, došlo ke značnému zjednodušení a zpřesnění zacilování na konkrétní místa v sekvenci DNA. Zinc-finger nukleázy i TALENy vyžadují navržení a syntézu proteinů, které dokáží rozeznat cílovou sekvenci na bázi interakce protein-DNA, což je finančně i časově náročnější proces, než je tomu při využití komplementárního párování RNA-DNA. CRISPR vyžaduje pouze tvorbu krátkých sekvencí RNA.[48]

Reference[editovat | editovat zdroj]

  1. Sawyer, Eric (9 February 2013). "Editing Genomes with the Bacterial Immune System". Scitable. Nature Publishing Group. Retrieved 6 April 2015.
  2. Marraffini LA, Sontheimer EJ (March 2010). "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea". Nature Reviews Genetics 11 (3): 181–190. doi:10.1038/nrg2749. PMC 2928866. PMID 20125085.
  3. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P (March 2007). "CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes". Science 315 (5819): 1709–1712. Bibcode:2007Sci...315.1709B. doi:10.1126/science.1138140. PMID 17379808
  4. Marraffini LA, Sontheimer EJ (December 2008). "CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA". Science 322 (5909): 1843–1845. Bibcode:2008Sci...322.1843M. doi:10.1126/science.1165771. PMC 2695655. PMID 19095942
  5. Marraffini LA, Sontheimer EJ (March 2010). "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea". Nature Reviews Genetics 11 (3): 181–190. doi:10.1038/nrg2749. PMC 2928866. PMID 20125085
  6. Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C (2007). "The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats". BMC Bioinformatics 8: 172. doi:10.1186/1471-2105-8-172. PMC 1892036. PMID 17521438
  7. Ledford, Heidi (3 June 2015). "CRISPR, the disruptor". News Feature. Nature 522 (7554).
  8. Snyder, Bill (21 August 2014). "New technique accelerates genome editing process". research news @ Vanderbilt. Nashville, Tennessee: Vanderbilt University.
  9. Hendel A, Bak RO, Clark JT, Kennedy AB, Ryan DE, Roy S, Steinfeld I, Lunstad BD, Kaiser RJ, Wilkens AB, Bacchetta R, Tsalenko A, Dellinger D, Bruhn L, Porteus MH (June 2015). "Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells". Nature Biotechnology 33: 985–9. doi:10.1038/nbt.3290. PMID 26121415
  10. Mali P, Esvelt KM, Church GM (October 2013). "Cas9 as a versatile tool for engineering biology". Nature Methods 10 (10): 957–63. doi:10.1038/nmeth.2649. PMC 4051438
  11. Ledford, Heidi (3 June 2015). "CRISPR, the disruptor". Nature 522 (7554): 20–24. doi:10.1038/522020a. PMID 26040877
  12. Overballe-Petersen S, Harms K, Orlando LA, Mayar JV, Rasmussen S, Dahl TW, Rosing MT, Poole AM, Sicheritz-Ponten T, Brunak S, Inselmann S, de Vries J, Wackernagel W, Pybus OG, Nielsen R, Johnsen PJ, Nielsen KM, Willerslev E (December 2013). "Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110 (49): 19860–5. Bibcode:2013PNAS..11019860O. doi:10.1073/pnas.1315278110. PMID 24248361. Lay summary – Kurzweil (19 November 2013).open access publication - free to read
  13. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A (Dec 1987). "Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product". Journal of Bacteriology 169 (12): 5429–33. PMC 213968. PMID 3316184
  14. Lander ES (Jan 2016). "The Heroes of CRISPR". Cell 164 (1-2): 18–28. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041
  15. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G (Apr 2000). "Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria". Molecular Microbiology 36 (1): 244–6. doi:10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x. PMID 10760181
  16. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G (Apr 2000). "Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria". Molecular Microbiology 36 (1): 244–6. doi:10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x. PMID 10760181
  17. Lander ES (Jan 2016). "The Heroes of CRISPR". Cell 164 (1-2): 18–28. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041. PMID 26771483.
  18. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (Mar 2002). "Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes". Molecular Microbiology 43 (6): 1565–75. doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. PMID 11952905
  19. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E (Feb 2005). "Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements". Journal of Molecular Evolution 60 (2): 174–82. doi:10.1007/s00239-004-0046-3. PMID 15791728
  20. Lander ES (Jan 2016). "The Heroes of CRISPR". Cell 164 (1-2): 18–28. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041. PMID 26771483.
  21. Lander ES (Jan 2016). "The Heroes of CRISPR". Cell 164 (1-2): 18–28. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041. PMID 26771483.
  22. Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G (Mar 2005). "CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies". Microbiology 151 (Pt 3): 653–63. doi:10.1099/mic.0.27437-0. PMID 15758212.
  23. Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD (Aug 2005). "Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin". Microbiology 151 (Pt 8): 2551–61. doi:10.1099/mic.0.28048-0. PMID 16079334.
  24. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (Mar 2002). "Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes". Molecular Microbiology 43 (6): 1565–75. doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. PMID 11952905.open access publication - free to read
  25. Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G (March 2005). "CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies". Microbiology 151 (Pt 3): 653–663. doi:10.1099/mic.0.27437-0. PMID 15758212.
  26. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E (February 2005). "Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements". Journal of Molecular Evolution 60 (2): 174–182. doi:10.1007/s00239-004-0046-3. PMID 15791728.
  27. Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD (August 2005). "Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin". Microbiology 151 (Pt 8): 2551–2561. doi:10.1099/mic.0.28048-0. PMID 16079334.
  28. Horvath P, Barrangou R (2010). "CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea". Science 327 (5962): 167–70. Bibcode:2010Sci...327..167H. doi:10.1126/science.1179555. PMID 20056882.
  29. Morange, M (June 2015). "What history tells us XXXVII. CRISPR-Cas: The discovery of an immune system in prokaryotes". Journal of Biosciences 2 (2): 221–223. doi:10.1007/s12038-015-9532-6. PMID 25963251.
  30. Pennisi E (August 2013). "The CRISPR craze". News Focus. Science 341 (6148): 833–836. doi:10.1126/science.341.6148.833. PMID 23970676
  31. Pennisi E (August 2013). "The CRISPR craze". News Focus. Science 341 (6148): 833–836. doi:10.1126/science.341.6148.833. PMID 23970676
  32. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (August 2012). "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity". Science 337 (6096): 816–821. Bibcode:2012Sci...337..816Jdoi:10.1126/science.1225829. PMID 22745249..
  33. Connor S (7 November 2013). "CRISPR gene therapy: Scientists call for more public debate around breakthrough technique". Science. London: The Independent. Retrieved 2013-11-25.
  34. DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (Apr 2013). "Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems". Nucleic Acids Research 41 (7): 4336–43. doi:10.1093/nar/gkt135. PMC 3627607. PMID 23460208.
  35. Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK (Mar 2013). "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system". Nature Biotechnology 31 (3): 227–9. doi:10.1038/nbt.2501.
  36. Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, O'Connor-Giles KM (Aug 2013). "Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease". Genetics 194 (4): 1029–35. doi:10.1534/genetics.113.152710. PMC 3730909. PMID 23709638.open access publication - free to read
  37. Flowers GP, Timberlake AT, McLean KC, Monaghan JR, Crews CM (May 2014). "Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease". Development 141 (10): 2165–71. doi:10.1242/dev.105072. PMC 4011087. PMID 24764077.open access publication - free to read
  38. Friedland AE, Tzur YB, Esvelt KM, Colaiácovo MP, Church GM, Calarco JA (Aug 2013). "Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system". Nature Methods 10 (8): 741–3. doi:10.1038/nmeth.2532. PMC 3822328. PMID 23817069.
  39. Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP (Nov 2013). "Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice". Nucleic Acids Research 41 (20): e188. doi:10.1093/nar/gkt780. PMC 3814374. PMID 23999092.open access publication - free to read
  40. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (May 2013). "One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering". Cell 153 (4): 910–8. doi:10.1016/j.cell.2013.04.025. PMID 23643243.
  41. Guo X, Li XJ (Jul 2015). "Targeted genome editing in primate embryos". Cell Research 25 (7): 767–8. doi:10.1038/cr.2015.64. PMID 26032266.Closed access
  42. Baltimore D, Berg P, Botchan M, Carroll D, Charo RA, Church G, Corn JE, Daley GQ, Doudna JA, Fenner M, Greely HT, Jinek M, Martin GS, Penhoet E, Puck J, Sternberg SH, Weissman JS, Yamamoto KR (2015). "Biotechnology. A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification". Science 348 (6230): 36–8. Bibcode:2015Sci...348...36B.
  43. Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (November 2013). "CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression". Nature Protocols 8 (11): 2180–96. doi:10.1038/nprot.2013.132. PMID 24136345.open access publication - free to read
  44. Pennisi E (August 2013). "The CRISPR craze". News Focus. Science 341 (6148): 833–836. doi:10.1126/science.341.6148.833. PMID 23970676.
  45. Pollack A (11 May 2015). "Jennifer Doudna, a Pioneer Who Helped Simplify Genome Editing". The New York Times. Retrieved 12 May 2015.
  46. Pennisi E (August 2013). "The CRISPR craze". News Focus. Science 341 (6148): 833–836. doi:10.1126/science.341.6148.833. PMID 23970676.
  47. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (August 2012). "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity". Science 337 (6096): 816–821. Bibcode:2012Sci...337..816J. doi:10.1126/science.1225829. PMID 22745249.
  48. Young S (11 February 2014). "CRISPR and Other Genome Editing Tools Boost Medical Research and Gene Therapy’s Reach". MIT Technology Review (Cambridge, Massachusetts: Massachusetts Institute of Technology). Retrieved 2014-04-13.