Methylace DNA

Z Wikipedie, otevřené encyklopedie
Skočit na: Navigace, Hledání
Umělecké ztvárnění methylovaného fragmentu DNA (methylace na dvou cytosinech ve střední části molekuly)

Methylace DNA je pojem, kterým rozumíme modifikaci nukleových bází cytosinu a adeninu kovalentním připojením methylového zbytku. U adeninu je methyl připojen na šestý dusík, u cytosinu buďto na čtvrtý dusík či pátý uhlík (5-methyl cytosin).[1][2]

Přítomnost 5-methyl cytosinu u eukaryot společně s post-translačními úpravami histonů patří mezi epigenetické modifikace DNA, kteréžto bez nutnosti změny genetického kódu regulují genovou expresi v dané buňce, čímž ovlivňují vývoj kmenových buněk a buněčnou diferenciaci. Methylace DNA mimoto hraje také roli v replikaci, rekombinaci a opravě DNA a supresi transponovatelných elementů a retrovirové DNA. Změny v epigenetických regulačních mechanismech provázejí proces stárnutí a za patologických podmínek přispívají ke vzniku rakoviny a autoimunitních či degenerativních onemocnění. Ztráta jedné z methyltransferáz, tedy enzymů, které katalyzují vznik 5-methylcytosinu a udržují tak methylační vzory, je letální.[1][3][4]

Přítomnost 5-methyl cytosinu je velmi prastará epigenetická modifikace DNA, která se vyskytuje jak u archebakterií, tak i u bakterií a eukaryot. U některých organismů však byla druhotně v průběhu evoluce ztracena, například u kvasinky Saccharomyces cerevisiae či u hlísta Caenorhabditis elegans.[5]

Methylace u bakterií[editovat | editovat zdroj]

U bakterií se vyskytují všechny tři typy methylovaných bází - 6-methyl adenine, 4-methyl cytosin i 5-methyl cytosin. Methylace DNA tu hraje především roli jako ochrana vlastní DNA před rozpoznáním restrikčními enzymy, které mají za úkol štěpit cizorodou bakteriofágovou nemethylovanou DNA. Mimoto také reguluje genovou expresi a procesy replikace a opravy DNA.[2]

Methylace DNA u savců[editovat | editovat zdroj]

Methylaci DNA, u savců tedy vznik 5-methyl cytosinu (5mC), katalyzují enzymy zvané methyltransferázy, které přenášejí methyl (alkyl methanu) z S-adenosyl-1-methioninu na pátý uhlík cytosinové báze.[6]

U savců představuje 5-methyl cytosin přibližně 1 % všech bází DNA a proto bývá označován jako báze pátá. V somatických buňkách se ve většině případů nachází v rámci symetrických CpG dinukleotidů (část DNA se dvěma bezprostředně následujícími bázemi, tedy 2 nukleosidy vázané fosfátem, zde cytosin(C)-fosfát(p)-guanosin(G)), i když v myších embryonálních buňkách můžeme kromě methylovaných CpG nalézt methylované i CpA či CpT dinukleotidy. CpG dinukleotidy se v rámci savčího genomu vyskytují nerovnoměrně a odhaduje se, že 70–80 % jich je methylováno. Můžeme tak nalézt jak oblasti, kde se CpG dinukleotidy vyskytují velmi zřídka, tak oblasti, které jsou na výskyt CpG bohaté. Tyto oblasti delší než 200 párů bází s vysokou frekvencí CpG (vyšší než 50 %) se nazývají CpG ostrůvky. Část těchto CpG ostrůvků se nachází v oblasti genových promotorů u 50 – 60 % lidských genů.[1]

Methylace DNA se u savců podílí na udržování genomové stability prostřednictvím inaktivace chromozomu X v samičích buňkách (lyonizace), potlačování transkripce repetitivních sekvencí a translokace transponovatelných elementů. Během zárodečného vývoje také kontroluje expresi imprintovaných genů. Uvnitř aktivních (transkribovaných) genů může ovlivňovat splicing mRNA. DNA methylace také ovlivňuje genovou expresi. A to tak, že buďto fyzicky zabrání transkripčním faktorům nasednout na jejich vazebné místo na DNA či že se díky ní na DNA navážou tzv. „proteiny vážící methylované CpG“ (ang. „methyl-CpG binding proteins“, MBP), které dále regulují chromatinovou strukturu nebo vazbu dalších regulačních faktorů.[5]

Dědičnost methylace DNA u savců[editovat | editovat zdroj]

O methylačních vzorech DNA v genomu se obecně předpokládá, že jsou ustanoveny v zárodečných buňkách během embryonálního vývoje a při vzniku somatických buněk pouze dochází k jejich dědění pomocí zachovávacího mechanismu.[7]

Původní model zachovávání[editovat | editovat zdroj]

Původní model model ze 70. let 20. století počítá s tím, že DNA methylace negativně ovlivňuje schopnost proteinů (např. transkripčních faktorů a jiných DNA regulačních proteinů) vázat se na DNA a tím ovlivňuje genovou expresi. Jednoduše řečeno u genu se tak zabrání transkripci. Zavedený model předpokládá, že u eukaryot existují dvě skupiny enzymů schopných methylovat cytosin (methyltransferáz). První skupina tzv. „de novo methyltransferáz“ ustanovuje methylační vzory v zárodečných buňkách embrya, kdežto druhá skupina, „zachovávající methyltranferázy“, se podílí na dědění těchto ustanovených vzorů v somatických buňkách. Tudíž se jejich funkce nepřekrývají.[7]

Původní model podporují následující poznatky. De novo methyltransferázy Dnmt3a a Dnmt3b ustanovují buněčné methylační vzory v embryonálních zárodečných buňkách, jelikož jsou v zárodečných buňkách exprimovány ve vysoké míře, kdežto v somatických buňkách je jejich exprese velmi omezena, a mají stejnou afinitu pro hemi-methylované i nemethylované cytosiny. Ztráta některého z těchto enzymů je letální. Zachovávající methyltransferáza Dnmt1 je v buňkách syntetizována především během S fáze buněčného cyklu, tedy během replikace DNA a díky interakci s polymerázovým faktorem PCNA je lokalizována na replikační vidličku, kde se váže na hemi-methylované cytosiny produkované při semikonzervativní replikaci DNA a methyluje druhý cytosin v CpG dinukleotidu na nově vzniklém vlákně DNA. Aktivita Dnmt1 je postradatelná pro vývoj zárodečných buněk, kdežto při vývoji embrya je nepostradatelná a její ztráta je letální. Taktéž její absence v diferencovaných buňkách způsobuje apoptózu neboli programovanou buněčnou smrt prostřednictvím proteinu p53.[7]

Nový model[editovat | editovat zdroj]

V posledních letech byly ale nashromážděny nové poznatky, které jsou v rozporu s původním modelem. Kupříkladu původní model předpokládá, že by se hemi-methylované CpG dinukleotidy měly vyskytovat v genomu pouze v nepatrném množství, jelikož by naprostá většina z nich měla být hned po replikaci plně methylována prostřednictvím Dnmt1 methyltransferázy. V genomu se však hemi-methylované CpG dinukleotidy objevují v měřitelném množství. Mimoto přesnost dědičných vzorů methylace je komplikovanější než se původně předpokládalo. Dále většina CpG ostrůvků, které se nachází v oblastech transkripčních počátků genů, je nemethylovaná a to nezávisle na míře exprese daného genu - výjimkami jsou geny na inaktivovaném X chromozomu, geny specifické pro zárodečné buňky a několik dalších genů. Dalším nedostatkem původního modelu je nepřítomnost korekčního mechanismu, který je v buňce přítomný u všech důležitých procesů.[7]

Nový model předpokládá, že methylační vzory jsou děděny jako obecný status dané oblasti DNA namísto přesného kopírování vzoru methylace jednotlivé C báze z mateřského vlákna na dceřiné. K zachovávání methylačních vzorů je tak potřeba souhra mezi všemi methyltrasnerázami. Dnmt1 umístěná na replikační vidličku ve spojení s proteinem UHRF1 zachovává většinu methylačního vzoru díky methylaci hemi-methylovaných CpG dinukleotidů. Tento proces je nezávislý na stavu okolního chromatinu, tedy zda se replikovaná oblast nachází v euchromatinu (transkribovaná oblast DNA) či heterochromatinu (umlčená nepřepisovaná oblast DNA). DNmt3a a DNmt3b se naproti tomu vážou na nukleosomy a methylují místa vynechaná methyltranferázou Dnmt1 v závislosti na přítomnosti epigenetických modifikací histonů v daných nukleosomech.[7]

Demethylace DNA[editovat | editovat zdroj]

Proces demethylace DNA, tedy odstranění methylu z 5-methylcytosinu, může probíhat buďto pasivně, a to tak že při replikaci nedochází k nové methylaci hemi-methylovaných míst, či aktivně na replikaci nezávislým způsobem. Aktivní demethylace na celogenomové úrovni probíhá v zygotách a v pluripotentních zárodečných buňkách a aktivní demethylace určitých oblastí DNA je známá u neuronů či T lymfocytů. Nicméně mechanismy, jakými aktivní demethylace probíhá, jsou nám stále neznámé. Předpokládá se však, že jich bude existovat celá řada.[6]

Jedním z nich by mohl být proces založený na principu opravného systému pro kód DNAexcize bází (angl. „base excision repair“) neboli odstraňování chybných bází. Tento proces by pak mohl probíhat přímo půspbením 5mC-specifickou glykosylázy (prokázáno pouze u rostlin) či po modifikaci 5-methyl cytosinu například deaminací. Po deaminaci 5-methyl cytosinu vzniká thymin, který nepáruje s protilehlým guanosinem. T-G je poté vyhledáno opravným systémem DNA a nepárující dvojice T-G je odstraněna. Dalším možným kandidátem je další opravný systém DNAexcize nukleotidů (ang. Nucleotide excision repair“). Také nedávno objevené enzymy (TET1, TET2 a TET3), které modifikují 5-methyl cytosine na 5-hydroxymethylcytosine se mohou podílet na aktivní demethylaci DNA.[6]

Metody detekce methylace DNA[editovat | editovat zdroj]

  • PCR specická pro detekci methylace. DNA je nejdříve ošetřena bisulfitem sodným, který konvertuje nemethylované cytosiny na uracily, kdežto 5-methyl cytosiny ponechává v nezměněném stavu. Pro polymerázovou řetězovou reakci jsou použity dva typy primerů – specifické pro methylovanou DNA a specifické pro nemethylovanou DNA. Dle míry amplifikace jednotlivých úseků DNA při srovnání jedné a druhé skupiny primerů je možné určit, zda je oblast DNA methylovaná či nikoliv.[8]
  • HELP assay (angl. „HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR). Tato metoda je založena na funkci 2 restrikčních enzymů HpaII a MspI. Oba tyto enzymy štěpí DNA v místě výskytu sekvence 5‘-CCGG-3‘. MspI štěpí DNA ve všech místech výskytu této sekvence, kdežto HpaII štěpí pouze pokud je cytosin v prostředním CpG dinukleotidu nemethylovaný. Vzniklé fragmenty DNA jsou odděleně amplifikovány polymerázovou řetězovou reakcí a označeny dvěma různými fluorescenčními barvičkami. Porovnání stavu methylace/nemethylace různých oblastí DNA je zjišťováno pomocí microarray čipu porovnáním množství MspI a HpaII fragmentů.[9] K analýze výsledků z HELP, zvláště na celogenomové úrovni, jsou používány například předdefinované funkce v programovacím jazyku R.[10]
  • Imunoprecipitace DNA methylace. DNA je nejprve náhodně štěpena na fragmenty o velikosti 300 – 1000 párů bazí (bp) a denaturována na jedno-vláknovou ssDNA. Na takto získané ssDNA jsou dále navázány 5-methyl cytosin specifické monoklonální protilátky. Stejně jako při klasické imunoprecipitaci, jsou DNA fragmenty obsahující 5-methyl cytosin navázány přes systém dalších protilátek specifických jedna pro druhou na magnetické kuličky, kdežto DNA fragmenty neobsahující žádný methylovaný cytosin jsou odmyty. DNA společně s protilátkami je poté eluována do roztoku a přečištěna proteinázou K, která štěpí proteiny – tedy v tomto případě protilátky. Takto připravená a přečištěná DNA je poté připravena k detekci. Ta může probíhat buďto pomocí microarray čipů či vysokofrekvenčním sekvenováním.[11]
  • Celogenomové sekvenování. DNA je nejdříve ošetřena bisulfitem sodným, který konvertuje nemethylované cytosiny na uracily, kdežto 5-methyl cytosiny ponechává v nezměněném stavu. Následně je takto ošetřená DNA sekvenována metodou tzv. sekvenování nové generace.[12] Vzniklé sekvence musí být poté bioinfromaticky namapovány na referenční genom a dále zkoumány.[13]

Databáze methylace[editovat | editovat zdroj]

Informaci o tom, jaké cytosiny v genomu jsou methylované můžeme nalézt například v databázi MethDB, která kromě základních lokálních dat obsahuje i informace získané z celogenomových sekvenování či predikčních algoritmů. Kromě samotných dat se snaží poskytovat i co nejširší spektrum informací o původu vzorku, způsobu jeho zpracování, vyhodnocení, atd. Do databáze je možné také nahrávat vlastní data, neposkytuje však žádný analytický software pro jejich vyhodnocení.[14]

Existují také databáze zachycující methylační vzory u buněk, které prošly nějakým patologickým vývojem – například rakovinotvornou přeměnou. DiseaseMeth je databáze zachycující methylaci DNA u různých lidských nemocí, která obsahuje více než 14 000 záznamů.[15] Další užitečnou databází zachycující methylační vzory u rakovinných buněk je belgická PubMeth, která obsahuje více než 5 000 anotovaných záznamů vytvořených z 1 000 publikací.[16] Informace o methylaci DNA u rakoviny je dohledatelná i v čínské databázi MethyCancer.[17]

Polohu CpG ostrůvků a jejich případnou methylaci v různých buněčných typech můžeme zobrazit v internetovém prohlížeči UCSC Genome Browser.[18]

Reference[editovat | editovat zdroj]

  1. a b c Kim JK, Samaranayake M, Pradhan S(2009).  "Epigenetic Mechanisms in Mammals". Cell Mol Life Sci 66 (4): 596-612. doi:10.1007/s00018-008-8432-4. PMID 18985277. 
  2. a b Albu RF, Jurkowski TP, Jeltsch A(2012).  "The Caulobacter crescentus DNA-(adenine-N6)-methyltransferase CcrM methylates DNA in a distributive manner". Nucleic Acids Res 40 (4): 1708-16. doi:10.1093/nar/gkr768. PMID 21926159. 
  3. Hashimoto H, Vertino PM, Cheng X(2010).  "Molecular Coupling of DNA Methylation and Histone Methylation". Epigenomics 2 (5): 657-69. PMID 21339843. 
  4. Cheng X, Blumenthal RM(2008).  "Mammalian DNA methyltranferases: a structural perspective". Structure 16 (3): 341-50. doi:10.1016/j.str.2008.01.004. PMID 18334209. 
  5. a b Buck-Koehntop BA, Defossez PA(2013).  "On how mammalian transcription factors recognize methylated DNA". Epigenetics 8 (2): 131-7. doi:10.4161/epi.23632. PMID 23324617. 
  6. a b c Chen ZX, Riggs AD(2009).  "DNA methylation and demethylation in mammals". J Biol Chem 286 (21): 18347-53. doi:10.1074/jbc.R110.205286. PMID 21454628. 
  7. a b c d e Jones PA, Liang G(2009).  "Rethinking how DNA methylation patterns are maintained". Nat Rev Genet 10 (11): 805-11. doi:10.1038/nrg2651. PMID 19789556. 
  8. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB(1996).  "Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands". Proc Natl Acad Sci U S A 93 (18): 9821-9826. PMID 8790415. 
  9. Khulan B, Thompson RF, Ye K, Fazzari MJ et al.(2006).  "Comparative isoschizomer profoling of cytosine methylation: the HELP assay". Genome Res 16 (8): 1045-55. PMID 16809668. 
  10. Thompson RF, Reimers M, Khulan B, Gissot M et al.(2008).  "An analytical pipeline for genomic represenattion used for cytosine methylation studies". Bioinformatics 24 (9): 1161-7. PMID 18353789. 
  11. Wilson IM, Davies JJ, Weber M, Brown CJ et al.(2006).  "Epigenomics: apping the methylome". Cell Cycle 5 (2): 155-8. PMID 16397413. 
  12. Miura F, Enomoto Y, Dairiki R, Ito T(2012).  "Amplification-free whole-genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging". Nucleic Acids Res 40 (17): e136. PMID 22649061. 
  13. Hansen KD, Langmead B, Irizarry RA(2012).  "BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions". Genome Biol 13 (10): R83. PMID 23034175. 
  14. http://www.methdb.de/
  15. Jie L, Hongbo L, Jianzhong S, Xueting W et al..  "DiseaseMeth: a human disease methylation database". Nucleic Acid Res. 
  16. http://www.pubmeth.org/
  17. He X, Chang S, Thang J, Zhao Q et al.(2008).  "MethyCancer: the database of human DNA methylation and cancer". Nucleic Acid Res. 
  18. http://genome.ucsc.edu/