Fosforylace

Z Wikipedie, otevřené encyklopedie
Skočit na: Navigace, Hledání
Fosforylovaný serinový zbytek

Fosforylace je adice fosfátových skupin (PO 3−
4
 ) na proteiny nebo jiné organické molekuly. Může měnit strukturu proteinů v enzymech a tím i jejich funkci a činnost. Fosforylace proteinů hraje významnou roli v celé řadě buněčných procesů. Z tohoto důvodu se stává předmětem řady biochemických výzkumů

Fosforylace proteinů[editovat | editovat zdroj]

Historie[editovat | editovat zdroj]

V roce 1906 Phoebus A. Levene v Rockefellerově ústavu pro lékařský výzkum identifikoval fosfát v bílkovině vitellin,[1] a v roce 1933 Fritz Lipmann objevil fosfoserin v kaseinu.[2] Nicméně trvalo dalších 20 let, než Eugene P. Kennedy popsal první "enzymatickou fosforylaci proteinů".[3]

Funkce[editovat | editovat zdroj]

Reverzibilní fosforylace proteinů je důležitý regulační mechanismus, který se vyskytuje u prokaryotických i eukaryotických organismů.[4][5][6][7] Kinázy fosforylují bílkoviny a fosfatázy bílkoviny defosforylují. Mnohé enzymy a receptory jsou ve stavu "zapnutý" nebo "vypnutý" prostřednictvím fosforylace a defosforylace. Reverzibilní fosforylace vede ke konformačním změnám struktury mnohých enzymů a receptorů, které způsobují aktivaci nebo deaktivaci. Fosforylace se v eukaryotických proteinech obvykle vyskytuje na aminokyselinách serin, threonin, tyrosin a histidinových zbytcích. Histidinová fosforylace eukaryotických proteinů je častější než fosforylace na tyrosinu. V prokaryotických bílkovinách dochází k fosforylaci zbytků aminokyselin serin, threonin, tyrosin, histidin, arginin nebo lysin.[4][5][8][8][9] Přidáním fosfátových molekul (PO4) na polární R skupiny aminokyselinových zbytků se mohou změnit hydrofobní části proteinu na polární a extrémně hydrofilní část molekuly. Tímto způsobem je možné zavést konformační změnu ve struktuře proteinu prostřednictvím interakce s jinými hydrofobními a hydrofilními částmi proteinu. Jeden takový příklad regulace je fosforylace p53 tumor supresorových proteinů. Protein p53 je silně regulován[10] a obsahuje více než 18 různých míst fosforylace. Aktivace p53 může vést k zástavě buněčného cyklu, který může být obrácen a za určitých okolností může vést k apoptotické buněčné smrti.[11] Tato aktivita se vyskytuje pouze v situacích, kdy jsou buňky poškozené, nebo je u zdravých jedinců narušená jejich fyziologie. Po deaktivačním signálu je protein znovu defosforylován a přestane fungovat. Aktivace fosforylací je mechanismus, který se vyskytuje v mnoha formách přenosu signálů, jako například způsob, jakým se světlo zpracovává ve světločivných buňkách sítnice.

Regulační role fosforylace:

  • Termodynamika biologických systémů pro reakce vyžadující energii
    • Fosforylace Na+/K+-ATPázy během přepravy sodíkových (Na+) a draslíkových (K+) iontů přes buněčnou membránu v osmoregulaci pro udržení homeostázy v těle.
  • Zprostředkování inhibice enzymu
    • Fosforylace enzymu GSK-3 pomocí protein kinázy B jako součást inzulinové signální dráhy.[12]
    • Fosforylace Src tyrozin kinázy přes C-terminální Src kinázu (Csk) indukuje konformační změnu v enzymu, která zakrývá jeho kinázové domény, a tak se vypne kinázová aktivita.[13]
  • Protein-proteinové interakce prostřednictvím "rozeznávacích domén"
    • Fosforylace cytosolických komponentů NADPH oxidázy, což je velký membránově vázaný multi-proteinový enzym přítomný u fagocytárních buněk, hraje důležitou roli v regulaci protein-proteinových interakcí v tomto enzymu.[14]
  • Degradace proteinů
    • V roce 1990 bylo zjištěno, že fosforylace některých proteinů způsobuje jejich degradaci přes ATP-dependentní ubiquitin / proteazomové dráhy. Tyto cílové proteiny se stanou substráty pro jednotlivé E3 ubiquitin ligázy pouze tehdy, jsou-li fosforylovány.

Signální dráhy[editovat | editovat zdroj]

Objasnění komplexní signální dráhy fosforylace může být obtížné. V buněčných signálních drahách protein A fosforyluje protein B a protein B pak fosforyluje protein C. Nicméně, v jiných signálních drahách protein D fosforyluje protein A, nebo fosforyluje protein C. Globální přístupy jako je fosfoproteomika (což je studium fosforylovaných proteinů prostřednictvím proteomiky v kombinaci s hmotnostní spektrometrií), byly využity k identifikaci a kvantifikaci dynamických změn fosforylovaných proteinů v průběhu času. Tyto techniky jsou důležité pro systematickou analýzu komplexních fosforylačních sítí.[15] Byly úspěšně použity k identifikaci dynamických změn ve stavu fosforylace na více než 6000 místech po stimulaci epidermálním růstovým faktorem.[16]

Jiný přístup k pochopení fosforylačních sítí je na základě měření genetické interakce mezi více fosforylovanými proteiny a jejich cíli. To ukazuje zajímavé opakující se vzorce interakcí tzv. síťové motivy.[17]

Místa proteinové fosforylace[editovat | editovat zdroj]

Existuje tisíce různých fosforylačních míst v dané buňce, protože:

  • Existuje tisíce různých druhů bílkovin v konkrétní buňce (například lymfocytů)
  • Odhaduje se, že 1/10 až 1/2 proteinů je fosforylována (v určitém buněčném stavu)
  • Fosforylace se často vyskytuje na několika různých místech na daném proteinu

Fosforylace jakéhokoli místa na daném proteinu může změnit funkci nebo lokalizaci tohoto proteinu. Například, pokud je aminokyselina Serin-473 ("S473") v proteinu AKT fosforylována, protein kináza B je funkčně aktivní jako kináza. Pokud protein kináza B není fosforylována, je to neaktivní kináza.

Typy fosforylace[editovat | editovat zdroj]

Uvnitř bílkoviny může dojít k fosforylaci na několika aminokyselinách. Fosforylace na serinu je nejčastější, hned za ním následuje threonin. Tyrosinová fosforylace je poměrně vzácná. Vzhledem k tomu, že tyrosin-fosforylované proteiny je poměrně snadné purifikovat pomocí protilátek, jsou fosforylace prostřednictvím tyrosinu poměrně dobře prozkoumané. Fosforylace histidinu a aspartátu se vyskytují hlavně u prokaryot jako součást dvousložkové signalizace. V některých specifických případech se může vyskytovat také v signálních drahách u eukaryot.[18]

Detekce a charakterizace[editovat | editovat zdroj]

Protilátky mohou být použity jako výkonné nástroje pro detekci toho, zda je protein na určitém místě fosforylován. Protilátky vážou a detekují konformační změny vyvolané fosforylací proteinů. Tyto protilátky se nazývají fosfo-specifické. Nyní jsou k dispozici stovky těchto protilátek.[19] Jsou to důležité biochemické nástroje a to jak pro základní výzkum, tak pro klinické diagnózy.

Příklad posttranslační modifikace detekované na 2D gelu YUI(hranice byly vymezené podle analytického softwaru, identifikace byla provedena hmotnostní spektrometrií, P46462 je ID proteinu v Expasy)

Posttranslační modifikace[editovat | editovat zdroj]

PTM (Posttranslační modifikace) izoformy jsou snadno zjistitelné na 2D gelu. Fosforylace nahrazuje neutrální hydroxylové skupiny na serinech a threoninech nebo tyrosinech za negativně nabité fosfátové skupiny s pKs kolem 1.2 a 6.5. Pod pH 5,5 fosfáty přidají jeden záporný náboj, u pH 6,5 přidávají 1,5 záporného náboje, nad pH 7,5 přidávají 2 záporné náboje. Relativní množství každé izoformy může být také snadno a rychle určeno z intenzity zbarvení na 2D gelu. V některých velmi specifických případech, je možné detekovat fosforylaci jako posun v proteinu. Tuhle elektroforetickou pohyblivost lze provádět pomocí jednoduchých 1-rozměrných SDS-PAGE gelů, jak je to popsáno například pro transkripční koaktivátor v článku Kovacs et al.[20] Většina fosforylačních míst, pro které byly tyto mobilní posuny popsány spadají do kategorie SP a TP míst. (tj. prolinové zbytky následované fosforylovanými serinovými nebo threoninovými zbytky). Nedávné rozsáhlé analýzy hmotnostní spektrometrie byly použity k určení místa fosforylace proteinů. Za poslední 4 roky, desítky studií zveřejnily každou identifikaci tisíců míst, z nichž dříve mnohé nebyly popsány.[21][22] Hmotnostní spektrometrie je ideální pro takové analýzy, pro které přidávání fosforylace vede ke zvýšení množství proteinů a fosforylovaného zbytku. Nicméně, pokročilé, vysoce přesné hmotnostní spektrometry jsou u těchto studií nezbytné, což představuje omezení pouze na laboratoře s nejmodernějšími hmotnostními spektrometry.

Podrobná charakterizace lokalit fosforylace je velmi obtížná, a kvantifikaci proteinů fosforylací pomocí hmotnostní spektrometrie vyžaduje vnitřní standardní přístupy s použitím izotopů [23] Relativní kvantifikaci lze získat s různými diferenciálními technologiemi, například označování prostřednictvím izotopů.[24] Existuje také několik kvantitativních metod proteinové fosforylace, včetně fluorescenčních a imunologických, FRET, TRF, fluorescenční polarizace, fluorescenční spektroskopie, gelová retardační analýza (EMSA), bead-based detekce (metoda pozostávájící ze třech prvků: kulička (průměrem 5,6-micromů), oligomerní zachycovací sondy připojené k povrchu a tři fluorofory pro multiplexní detekci), cell-based metody (metody založené na bázi buněčných testů se vztahují na některý z řady různých experimentů založených na použití živých buněk. Tyto metody můžou obsahovat různé testy, které měří proliferaci buněk, toxicitu, motilitu, měřitelnou výrobu produktu, a morfologii buněk. Cell-based testy nabízejí přesnější vyjádření reálného života v modelu, protože jsou používány živé buňky, a také nabízejí možnost dynamického experimentu prostřednictvím sledování množství nebo chování živých buněk).[25][26]

Jiné druhy[editovat | editovat zdroj]

ATP, "vysoce energetické" výměnné médium v buňce, je syntetizováno v mitochondriích přidáním třetí fosfátové skupiny na ADP v procesu nazvaném oxidační fosforylace. ATP je také syntetizováno během procesu glykolýzy. Další způsob tvorby ATP je syntetizace na úkor sluneční energie v procesu fotofosforylace v chloroplastech rostlinných buněk. Fosforylace cukrů je často první fáze jejich katabolismu. To umožňuje buňkám hromadit cukry, protože fosfátová skupina brání molekulám difundovat zpátky přes jejich transportéry.

Reference[editovat | editovat zdroj]

V tomto článku byl použit překlad textu z článku Phosphorylation na anglické Wikipedii.

  1.  "The cleavage products of vitellin"(1906). J. Biol. Chem. 2 (1): 127–133. 
  2.  "Serinephosphoric acid obtained on hydrolysis of vitellinic acid"(October 1932). J. Biol. Chem. 98 (1): 109–114. 
  3.  "The enzymatic phosphorylation of proteins"(December 1954). J. Biol. Chem. 211 (2): 969–80. PMID 13221602. 
  4. a b Cozzone AJ(1988).  "Protein phosphorylation in prokaryotes". Annu. Rev. Microbiol. 42: 97–125. doi:10.1146/annurev.mi.42.100188.000525. PMID 2849375. 
  5. a b  "Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria"(December 1989). Microbiol. Rev. 53 (4): 450–90. PMID 2556636. 
  6.  "The Two-Component System . Regulation of Diverse Signaling Pathways in Prokaryotes and Eukaryotes"(July 1998). Plant Physiol. 117 (3): 723–31. doi:10.1104/PPSOE.117.3.723. PMID 9662515. 
  7.  "The structure and mechanism of protein phosphatases: insights into catalysis and regulation"(1998). Annu Rev Biophys Biomol Struct 27: 133–64. doi:10.1146/annurev.biophys.27.1.133. PMID 9646865. 
  8. a b  "Phosphorylation of basic amino acid residues in proteins: important but easily missed"(2011). Acta Biochim Pol 58 (2): 137–47. PMID 21623415. 
  9.  "Ser/Thr/Tyr protein phosphorylation in bacteria - for long time neglected, now well established"(2005). J Mol Microbiol Biotechnol 9 (3–4): 125–31. doi:10.1159/000089641. PMID 16415586. 
  10.  "Regulation of p53 Function and Stability by Phosphorylation"(March 1999). Mol. Cell. Biol. 19 (3): 1751–8. PMID 10022862. 
  11.  "p53 in signaling checkpoint arrest or apoptosis"(February 1996). Curr. Opin. Genet. Dev. 6 (1): 12–8. doi:10.1016/S0959-437X(96)90004-0. PMID 8791489. 
  12.  "Essential role for protein kinase B (PKB) in insulin-induced glycogen synthase kinase 3 inactivation. Characterization of dominant-negative mutant of PKB"(May 1998). J. Biol. Chem. 273 (21): 13150–6. doi:10.1074/jbc.273.21.13150. PMID 9582355. 
  13.  "Protein tyrosine kinases Src and Csk: a tail's tale"(October 2003). Curr Opin Chem Biol 7 (5): 580–5. doi:10.1016/j.cbpa.2003.08.009. PMID 14580561. 
  14. Babior BM(March 1999).  "NADPH oxidase: an update". Blood 93 (5): 1464–76. PMID 10029572. 
  15.  "Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks"(November 2006). Cell 127 (3): 635–48. doi:10.1016/j.cell.2006.09.026. PMID 17081983. 
  16.  "Phosphoproteomics for the discovery of kinases as cancer biomarkers and drug targets"(2007). Proteomics - Clinical Applications 1 (9): 1042–1057. doi:10.1002/prca.200700102. PMID 21136756. 
  17.  "Functional Organization of the S. cerevisiae Phosphorylation Network"(2009). Cell 136 (5): 952–963. doi:10.1016/j.cell.2008.12.039. PMID 19269370. 
  18.  "Eukaryotic signal transduction via histidine-aspartate phosphorelay"(September 2000). J. Cell. Sci. 113 (18): 3141–50. PMID 10954413. 
  19. phospho antibody [online]. [cit. 2009-01-22]. Dostupné online. (anglicky) 
  20. Kovacs KA, Steinmann M; Magistretti PJ, Halfon O, Cardinaux JR(Sept. 2003).  "CCAAT/enhancer-binding protein family members recruit the coactivator CREB-binding protein and trigger its phosphorylation". J Biol. Chem. 278 (38): 36959–65. doi:10.1074/jbc.M303147200. ISSN 0021-9258. PMID 12857754. 
  21.  "Qualitative and quantitative analyses of protein phosphorylation in naive and stimulated mouse synaptosomal preparations"(February 2007). Mol. Cell Proteomics 6 (2): 283–93. doi:10.1074/mcp.M600046-MCP200. PMID 17114649. 
  22.  "Quantitative analysis of synaptic phosphorylation and protein expression"(April 2008). Mol. Cell Proteomics 7 (4): 684–96. doi:10.1074/mcp.M700170-MCP200. PMID 18056256. 
  23.  "Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS"(June 2003). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12): 6940–5. doi:10.1073/pnas.0832254100. PMID 12771378. 
  24.  "Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags"(2002). J. Proteome Res. 1 (1): 47–54. doi:10.1021/pr015509n. PMID 12643526. 
  25. Olive DM(October 2004).  "Quantitative methods for the analysis of protein phosphorylation in drug development". Expert Rev Proteomics 1 (3): 327–41. doi:10.1586/14789450.1.3.327. PMID 15966829. 
  26.  "A cell-based immunocytockemical assay for monitoring kinase signaling pathways and drug efficacy"(March 2005). Anal. Biochem. 338 (1): 136–42. doi:10.1016/j.ab.2004.11.015. PMID 15707944. 

Externí odkazy[editovat | editovat zdroj]